Tierschonende Probengewinnung bei Aviärer Influenza: eine empirische Studie

Die Aviäre Influenza (AI) ist in Europa seit 2022 als endemisch anzusehen (FLI 2023). Über das ganze Jahr verteilt treten neben den Wildvögeln auch bei Nutzgeflügel (Puten, Legehennen, Masthähnchen, Enten und Gänsen) Influenza-H5N1-Infektionen auf. Eine windvermittelte Übertragung von Influenzaviren in die Betriebe wird nicht mehr ausgeschlossen, sodass eine alleinige Intensivierung der betrieblichen Biosicherheitsmaßnahmen nicht ausreicht, um sich sicher vor einer Infektion zu schützen (Lüder et al. 2020). Um infizierte Geflügelbestände möglichst unverzüglich zu identifizieren, sind eine schnelle und aussagekräftige Probennahme und Diagnostik insbesondere in geflügeldichten Gebieten notwendig. Die Einzeltierdiagnostik am erkrankten oder verendeten Vogel ist einfach und sicher in der Aussage, während die Untersuchung einer größeren Geflügelherde bzw. eines Geflügelbestandes auf das Vorhandensein oder Freisein von einer Influenzainfektion deutlich schwieriger ist.

Angeregt wurde die tierschonende Probenahme über die Tränke zum einen durch die Probengewinnung mit sogenannten Kauseilen bei der Untersuchung von Schweinebeständen auf PRRS-Virus – nicht den Tupfer zum Tier, sondern das Tier zum Tupfer bringen – (Kittawornrat et al. 2010) und zum anderen durch die Suche nach Coronavirusvarianten in den Abwässern von Städten während der Corona-Pandemie, die Sensitivität und Spezifität der PCR-Untersuchung ausnutzen (D’Aoust et al. 2021, Bonanno Ferraro et al. 2022). Untersuchungen von Stallknecht et al. (1990) unterstützen diese Annahme. Stallknecht konnte über einen Zeitraum von 60 Tagen in unbehandeltem Wasser noch infektionsfähiges AI-Virus nachweisen.

Sind in einer mit AI infizierten Herde Tränketupferproben genauso sensitiv und sicher wie Proben aus dem Oropharynx (Schnabelrachen)? Dazu ist in einem Putenbestand (5.000 Hähne, 18. Lebenswoche) mit Verdacht auf eine Influenza-H6N1-Infektion nach dem Auftreten erster Atemwegsgeräusche von fünf klinisch auffälligen Putenhähnen jeweils ein Rachentupfer genommen worden. Parallel sind in der Herde fünf über den Stall verteilte Tränken mit einem Tupfer beprobt worden. Die fünf Rachen- und die fünf Tränketupferproben sind jeweils im 5er-Pool in der Influenza-H6-PCR untersucht worden.

Sind die in der Influenza-A-PCR und Influenza-H-PCR ermittelten ct-Werte vergleichbar? Der ct-Wert gibt einen Hinweis auf die in der Probe vorhandene Virusmenge. Dazu sind zehn H5N1-positive Tränketupfer aus einer mit H5N1 infizierten Putenherde einzeln in der Influenza-A-PCR und in der Influenza-H-PCR untersucht worden.

Sind Proben, die aus der Tränke genommen worden sind, sensibler als Sockenproben aus der Einstreu? Influenzaviren werden über die Atemwege und über den Magen-Darm-Kanal ausgeschieden (Alexander et al. 1980). Um zu untersuchen, ob der Virusnachweis in der Tränke oder der Virusnachweis im Kot sensitiver ist, sind in zwei Putenbetrieben zeitgleich Tränkeproben und Sockenproben genommen worden. Im ersten Betrieb waren in Stall 1 (5.000 Putenhähne im Alter von 19 Wochen) bereits 2 % der Tiere an H5N1 verendet und die Wasser- und Futteraufnahme stark zurückgegangen. In Stall 2 (direkt daneben, auch 5.000 Putenhähne im Alter von 19 Wochen) waren noch keine toten Puten und kein Wasser- und Futterrückgang zu beobachten. Im zweiten Putenbetrieb (ebenfalls zwei nebeneinanderstehende Ställe, 3.200 Putenhähne im Alter von 16 Wochen) war in beiden Ställen eine klinische H6N1-Infektion mit starken Atemwegsgeräuschen sowie einem Futter- und Wasserrückgang aufgetreten. In beiden Putenbetrieben wurden in jedem Stall zehn Tränketupferproben und zwei Sockenpaare genommen. Die Sockenpaare und die Tränketupfer sind als Pool in der Influenza-A-PCR untersucht worden.

Hat die Untersuchungsmethode einen Einfluss auf das PCR-Ergebnis? In einem Putenbestand (5.000 Putenhähne im Alter von 18 Wochen) mit einer H5N1-Infektion sind zehn Tränken und in einem weiteren Putenbestand (4.000 Putenhähne im Alter von 16 Wochen) mit einer H6N1-Infektion ebenfalls zehn Tränken jeweils mit einem Tupfer beprobt worden. Die Proben aus beiden Betrieben sind als 10er-Pool sowohl in der Influenza-A-PCR und Influenza-H-PCR als auch mit einem vom FLI zugelassenen Antigenschnelltest untersucht worden. Verwendet wurde der Influenza-Schnelltest FASTest AIV Ag von der Firma Diagnostik MEGACOR in Österreich.

Haben Verunreinigungen und der hygienische Zustand der Tränken einen Einfluss auf das PCR-Ergebnis? Ob die Tränkehygiene einen negativen Einfluss auf ein positives PCR-Ergebnis haben kann, ist durch eine Verdünnung von einem Influenza positiven Tupfer mit neun verunreinigten negativen Tupfern untersucht worden. Dazu sind acht Tränketupfer aus einer H5N1-positiven Putenherde verwendet worden. Um sicherzustellen, dass die Virusgehalte in dem Einzeltupfer und dem mit neun negativen Tupfern in der 10er-Pool­untersuchung annähernd gleich sind, sind jeweils zwei Tupfer in einem mit 0,5 ml sterilem Wasser gefüllten Reagenzglas miteinander verrührt worden. Ein Tupfer ist in der Einzel-PCR und der andere Tupfer zusammen mit neun verunreinigten negativen Tupfern im 10er-Pool untersucht worden. Die negativen Tupfer stammten aus zwei Betrieben. Ein Betrieb hatte eine mäßige Tränkehygiene und der andere Putenbetrieb hatte eine sehr schlechte Tränkehygiene mit einer starken Biofilmbildung in den Rundtränken. Die vier 10er-Pools sind sowohl in der Influenza-A-PCR als auch in der Influenza-H-PCR untersucht worden.

Sind Nippeltränken mit Auffangschalen für einen Virusnachweis genauso geeignet wie Rundtränken mit offenem Wasserzugang? Um das zu testen, sind Proben eines Legehennenbestandes (5.000 Legehennen im Alter von 62 Wochen), der an Influenza-H6N1 erkrankt war, untersucht worden. Der Stall war in fünf Abteile mit jeweils 1.000 Hennen unterteilt. Die Legeleistung, die nicht für die einzelnen Abteile bestimmt werden konnte, war um insgesamt 30 % verringert. In drei der fünf Abteile waren zum Zeitpunkt der Probennahme bereits an Influenza-H6N1 verendete Tiere gefunden worden. In jedem der fünf Abteile sind mit sechs Tupfern insgesamt 30 Nippel/Schalen beprobt worden (mit jedem Tupfer fünf Nippel). Die so genommenen Tupferproben der einzelnen Abteile sind jeweils als Pool in der Influenza-A-PCR untersucht worden.

Wie sensitiv ist der Nachweis über Tränketupfer in einer frisch infizierten Herde? In einem Putenbetrieb mit zwei baugleichen und ca. zehn Meter auseinander stehenden Putenställen (je Stall 5.000 Putenhähne im Alter von 19 Wochen) waren in Stall 1 bei der morgendlichen Tierkontrolle fünf unerklärlich verendete Putenhähne aufgefunden worden. Auch der Wasser- und Futterverbrauch war etwas reduziert. Am Vorabend waren keine Auffälligkeiten vom Tierbetreuer festgestellt worden. In Stall 2 direkt daneben waren zu dem Zeitpunkt vom Tierbetreuer noch keine Auffälligkeiten feststellbar. Weil in der Region bereits einige H5N1-Infektionen aufgetreten waren, sind in jedem Stall sofort zehn einzelne Tränken mit einem Tupfer beprobt (Abb. 2) und einzeln in der Influenza-A-PCR auf Virus-RNA untersucht worden.

Haben Chlordioxid (ClO₂) und freies Chlor (Cl₂) einen negativen Einfluss auf das PCR-Ergebnis? Die Zugabe von 1,2 mg Chlor/Liter und 0,4 mg Chlordioxid/Liter zur Desinfektion von Trinkwasser ist erlaubt. In der Tierhaltung kommen beide Substanzen zur Keim­abtötung und Verhinderung einer Biofilmbildung zum Einsatz. Da im Feld keine Möglichkeit besteht, mit replikationsfähigen Influenzaviren zu arbeiten, sind Lebendviren eines Newcastle-Impfstoffes verwendet worden.

Wie lange ist Influenza-RNA nach einer Infektion in den Tränken nachweisbar? Ein Langzeitnachweis von HPAI-Virus ist nicht möglich, da positive Bestände sofort gekeult werden. Der Nachweis von Influenza-Virusmaterial in Tränken erfolgte deshalb an Herden, die mit LPAI-Viren (Low-Pathogenicity-Influenza-Virus) infiziert waren.

Während des Seuchenzuges im Winter/Frühjahr 2021/22 ist in diversen Putenbetrieben ein hochpathogenes Influenza-H5N1-Virus amtlich festgestellt worden. In einigen Betrieben sind parallel zu den offiziellen 40 Rachen-/Kloakentupfern vom betreuenden Tierarzt zusätzlich auch Tupferproben aus den Tränken genommen und ebenfalls auf H5N1-Virusmaterial untersucht worden. Von drei Betrieben (Betriebe A, B und C) werden hier die Ergebnisse vorgestellt. Alle Herden sind spätestens 48 Stunden nach der amtlich festgestellten H5N1-Diagnose gekeult worden.

Sowohl der Pool aus den fünf Rachenabstrichen als auch der Pool aus den fünf Tränketupfern lieferten positive Influenza-H-PCR-Test­ergebnisse. Die ct-Werte der Rachenabstriche wiesen eine deutlich geringere Viruslast (ct-Wert 35,8) im Vergleich zu den Abstrichen in/an den Tränken (ct-Wert 28,6) aus (Tab. 1). Eine Erklärung könnte sein, dass die Symptome der H6N1-Infektion bereits einige Tage vor der Probenentnahme in der Herde beobachtet wurden. In den Tagen konnte es zu einer vermehrten Ansammlung von virushaltigem Atemwegssekret in/an den Tränken kommen. Eine andere Erklärung wäre, dass nur eines der fünf beprobten Putenhähne Virus ausgeschieden hat oder dass die Tiere gerade am Anfang oder bereits wieder am Ende der Infektion gewesen sind und nur eine geringe Virusmenge ausgeschieden haben. Dies könnte die deutlich höhere Viruslast im Tränketupferpool erklären.

Die ct-Werte der zehn Tränkeabstriche waren sowohl in der Influenza-A-PCR als auch in der Influenza-H-PCR positiv. Die in der Influenza-A-PCR ermittelten ct-Werte lagen zwischen 30,6 und 35,3 und die in der Influenza-H-PCR zwischen 28,7 und 34,6 (Tab. 2). Die Ergebnisse der beiden PCR-Tests unterschieden sich nur geringfügig und dürften aus Sicht des Autors keinen nennenswerten Einfluss auf die Befundung einer positiven Influenzaherde haben (Meinung des Autors).

Der Virusnachweis aus dem Atmungstrakt in/an Tränken und aus dem Magen-Darm-Trakt über Sockenproben wurde in vier verschiedenen Ställen durchgeführt. In drei Ställen waren Influenza-Symptome erkennbar und in einem Stall gab es noch keine Hinweise auf eine AI-Infektion. Die Sockenproben aus den drei Ställen mit Influenzasymptomen lieferten ein positives Influenza-A-PCR-Test­ergebnis, wohingegen die Sockenprobe aus dem Stall ohne Influenzaklinik ein negatives Ergebnis gebracht hat. Aber in den Tränkeproben aller vier Ställe konnte Influenza-RNA nachgewiesen werden (Tab. 3). Auch wenn laut Literatur mehr Viren über den Magen-Darm-Trakt als über die Atemwege ausgeschieden werden (Heider et al. 1992), war der Nachweis von Virus-RNA in/an den Tränken aller vier Ställe positiv. Obwohl Atemwegssekrete nicht nur in/an die Tränken abgegeben werden, sondern auch über das Niesen oder beim Picken in die Einstreu gelangt, wirken sich vermutlich die großen Mengen an Fremd-RNA und Fremd-DNA im Kot negativ auf das PCR-Ergebnis aus. Aufgrund der geringeren Verunreinigung der Tränken mit Bakterien, Viren etc. sind Tränkeproben sensitiver beim Nachwies von Virus-RNA als Sockenproben. Zusätzlich kann man davon ausgehen, dass Inhibitoren aus dem Kot, die mit der PCR interferieren, und die Verteilung über eine größere Fläche vermutlich mit einer Ausdünnung des Virus verbunden sind.

Um in der täglichen Praxis eine Influenza-A-Infektion schnellstmöglich ausschließen zu können, gibt es ein Antigen-Schnelltest-Verfahren. Allerdings war der Schnelltest bei den Tränketupfern sowohl in den H5N1-positiven Betrieben als auch in dem H6N1-infizierten Betrieb negativ (Tab. 4). Die anschließende Untersuchung in der Influenza-A-PCR und der -H-PCR lieferte ein positives Ergebnis. Die geringen Virusmengen in/an den Tränken, die sich in den ct-Werten von 29,1 bis 35,0 widerspiegeln, sind zu gering, um eine Verfärbung im Antigen-Schnelltest hervorzurufen. Auch wenn die PCR-Technik zeitlich langsamer ist, so ist sie aber deutlich sensitiver.

Die Ergebnisse der vier H5N1-positiven Tränkeabstriche, die mit neun negativen, leicht mit Biofilm kontaminierten Abstrichtupfern und mit neun negativen, stark mit Biofilm kontaminierten Abstrichtupfern in einem 10er-Pool gemischt wurden, ergeben sowohl einen positiven Influenza-A-PCR- als auch einen positiven -H-PCR-Test (Tab. 5). Die Verdünnung und Kontamination mit Biofilm oder Schmutz haben einen geringen, aber wohl zu vernachlässigenden Einfluss auf einen positiven H5N1-Tränketupfer. Wie es sich verhält, wenn die Virusmenge in den Tränketupfern sehr niedrig ist und der ct-Wert > 38 beträgt, kann nicht bewertet werden. Dass zwei ct-Werte in der Influenza-A-PCR und ein ct-Wert in der Influenza-H-PCR in der Verdünnung einen etwas niedrigeren ct-Wert haben als in der unverdünnten Einzeluntersuchung, liegt wahrscheinlich daran, dass die acht im H5N1-positiven Bestand genommenen Tupfer nicht in einer Tränke, sondern in unterschiedlichen Tränken genommen worden sind. Die Viruslast ist nicht in allen Tränken gleich. Deshalb sind vor der Versuchsdurchführung jeweils zwei Tupfer in einem Reagenzglas mit 0,5 ml Aqua destillata verrührt worden. Dieses Vermischen stellt nur sicher, dass beide Tupfer H5N1-Virusmaterial enthalten. Es garantiert aber nicht, dass beide Tupfer danach die gleiche Virusmenge haben. Die Ergebnisse zeigen das auch sehr anschaulich.

Die Annahme, dass Geflügel bei der Wasseraufnahme mehr Atemwegssekrete in/an Rundtränken hinterlässt als bei der Wasseraufnahme aus Nippeltränken mit Auffangschale, konnte in diesem Versuch nicht bestätigt werden. Alle fünf Pools waren positiv in der Influenza-A-PCR (Tab. 6). Aus diesen Ergebnissen kann man aber keine Rückschlüsse ziehen, ob Virus-RNA in offenen Rundtränken früher als in/an Nippeltränken nachweisbar ist, weil die H6N1-Infektion in diesem Betrieb bereits seit einigen Tagen in der Herde vorhanden war. Die Proben aus Rundtränken stammten in diesen Untersuchungen immer aus frisch infizierten Beständen.

In Abbildung 2 sind die jeweiligen Tränken abgebildet, in/an denen die Proben genommen worden sind. In Stall Nr. 1 (mit fünf toten Puten) waren alle zehn Tränkeabstriche positiv. Im Stall Nr. 2 (ohne klinische Symptome) war Virus-RNA nur bei einer Tränke nachweisbar. Die ersten trüben (schläfrigen) Tiere waren in Stall Nr. 2 erst 24 Stunden später zu erkennen. Die zehn Einzelproben wurden zusätzlich in einem 10er-Pool untersucht. Sowohl der 10er-Pool aus Stall Nr. 1 als auch der 10er-Pool aus Stall Nr. 2 lieferten ein positives Influenza-A-PCR-Ergebnis (Tab. 7). Obwohl es in Stall Nr. 2 noch keine Hinweise auf eine H5N1-Infektion gab und nur in/an einer Tränke Virus-RNA nachgewiesen werden konnte, lieferten die Tränkeabstriche im 10er-Pool ein positives Influenza-A-PCR-Testergebnis. Dieses Ergebnis zeigt, dass eine positive Tränke zum Nachweis ausreicht und wie wichtig es ist, viele Tränken im Stall zu beproben, um eine Infektion möglichst früh zu erkennen.

Die Zugabe von Desinfektionsmitteln zur Hygienisierung des Tränkewassers ist in Geflügelfarmen häufig anzutreffen. Die Ergebnisse zeigen, dass innerhalb von 24 Stunden kein bedeutender Einfluss auf das ND-PCR-Ergebnis zu verzeichnen war (Tab. 8). Obwohl eine Verringerung der Viruslast über die Zeit erkennbar wurde (bis zu 6,4 ct-Werte), ergaben sich keine Unterschiede zwischen unbehandeltem und chlorhaltigem Tränkewasser. Ein RNA-Nachweis von Influenzaviren in/an Trinkern sollte zu ähnlichen Ergebnissen führen. Dieser positive RNA-Nachweis bedeutet jedoch nicht, dass die ND-Viren in den drei Ansätzen noch infektionsfähig waren. Ob andere Trinkwasserdesinfektionsmittel oder höhere Konzentrationen dieser Desinfektionsmittel Einfluss auf das PCR-Ergebnis haben, ist hier nicht untersucht worden.

Während des Influenza-Seuchenzuges im Winter/Frühjahr 2021/22 wurden in den Geflügelherden neben den hochpathogenen H5N1-Viren auch Influenzaviren der niedrig pathogenen Stämme H6N1 und H9N2 nachgewiesen. Nur aus diesem Grund war die Durchführung dieser Langzeitbeprobung möglich. Alle H5N1-positiven Herden wurden sofort gekeult, während sich die H6N1- und H9N2-infizierten Herden erholten und bis zur Schlachtung im Stall blieben. Insgesamt kam es in fünf Putenfarmen zu Influenza-H6N1-Infektionen und in zwei Putenfarmen zu einer Influenza-H9N2-Infektion. Die Tiere der LPAIV-infizierten Herden waren zwischen zehn und zwanzig Wochen alt. Die Tränkeproben sind immer an den Wochentagen Montag und Donnerstag vom Tierbetreuer genommen worden. Bei der Bewertung wurden die Tage zwischen zwei positiven Probenergebnissen auch als positiv gewertet. In vier Betrieben erfolgte die Influenza-Infektion zu einem so späten Zeitpunkt (19./20. Lebenswoche), dass die Tiere vor ihrer Schlachtung keine negativen Tränkeprobenergebnisse mehr liefern konnten. Die Ergebnisse zeigen, dass zwischen dem erst- und letztmaligen Nachweis von Virus-RNA mindestens zwölf Tage liegen. Ob die Viren so lange von den Tieren ausgeschieden und immer wieder von den Tieren von Neuem in die Tränken abgegeben werden oder ob sich die Viren so lange in den Tränken halten (Tenazität der RNA), kann mit diesen Ergebnissen nicht ermittelt werden (Tab. 9). Da die Tränkeproben immer nur an zwei Tagen (Montag, Donnerstag) entnommen wurden, kann die Herdenausscheidungszeit auch ein bis drei Tage länger sein. Auch diese positiven PCR-Ergebnisse in/an den Tränken bedeuten nicht, dass die nachgewiesenen Influenzaviren im ermittelten Zeitraum auch noch infektiös gewesen sind.

In diesen drei Betrieben wurden durch die staatliche Untersuchung Influenzaviren des hochpathogenen Influenzastamms H5N1 nachgewiesen. In den 60 Rachen-/Kloakalabstrichen, die von einem amtlich bestellten Veterinär entnommen worden sind, wurde im staatlichen Prüflabor der HPAI-Stamm H5N1 nachgewiesen. Alle Tiere wurden innerhalb von 48 Stunden nach der offiziellen Probenahme getötet. Nachfolgend werden die Ergebnisse der parallel vom betreuenden Tierarzt entnommenen Tränkeabstriche dargestellt. Der klinische Verlauf der Influenza H5N1 zeigte sich in den Betrieben in erster Linie durch plötzlich auftretende Tierverluste, ohne dass eine ersichtliche Klinik/Ursache für die toten Puten erkennbar war. Deshalb sind in den Tabellen 10, 11 und 12 die täglichen Ausfälle zum Zeitpunkt der Diagnostik in morgens (m) und abends (a) unterteilt worden.

Die Einzeltierdiagnostik am erkrankten oder verendeten Tier ist einfach und sicher in der Aussage. Die Untersuchung einer größeren Geflügelherde auf das Vorhandensein einer Influenzainfektion ist deutlich schwieriger. Nur eine statistisch abgesicherte Anzahl von beprobten Tieren liefert eine sichere Aussage über den Herdenstatus. Geflügel scheidet die Influenzaviren über die Atemwegssekrete aus. Dabei kontaminieren sie nach einer Infektion bei der Wasseraufnahme bereits sehr früh die Tränken. Virale RNA ist in/an den Tränken nachweisbar, noch bevor die ersten Symptome auftreten oder Tiere an der Infektion sterben (Sieverding 2022). Dies wird auch von den Untersuchungen von Muñoz-Aguayo et al. (2019) bestätigt. Sie konnten Virusmaterial im Biofilm von Stalltränken einer an LPAI infizierten Putenherde in der PCR ein bis zwei Tage früher nachweisen als in oropharyngealen Proben. Im Praxisversuch 1 war virale RNA in einer H5N1-infizierten Putenherde bereits 24 Stunden vor dem Auftreten erster klinischer Anzeichen in den Tränkeproben nachweisbar. Muñoz-Aguayo et al. (2019) konnten ebenfalls nachweisen, dass Influenza-RNA für mehrere Tage bis hin zu Wochen im Tränkebiofilm nachweisbar blieb. Praxisversuch 9 ergab vergleichbare Ergebnisse. Nach der Infektion einer Putenherde mit AI betrug die Virusausscheidungszeit der Herden, die mittels PCR-Technik in Tränketupfern ermittelt wurde, mindestens zwölf Tage.

Die neue EU-Verordnung (EU-Verordnung 2023) ermöglicht bei der Bekämpfung und Kontrolle der AI (HPAI) eine Kombination aus Impfung und Keulung. Die wichtigste Anforderung besteht darin, dass ein geimpfter Bestand einmal im Monat getestet und überwacht wird, ob eine Infektion mit einem AI-Feldstamm vorliegt. Jede geimpfte Herde muss bis zur Schlachtung einmal im Monat getestet werden. Um der EU-Verordnung gerecht zu werden, ist eine statistisch sichere Methode erforderlich. Derzeit werden pro Herde 60 Rachen-/Kloakalabstriche genommen. Die Umstellung auf die Entnahme von Abstrichtupfern in/an Tränken würde die Influenza-Überwachung einer geimpften Herde praktikabler und kostengünstiger machen, in der Hoffnung, dass die diagnostische Qualität erhalten bleibt.

Der Autor versichert, während des Entstehens der vorliegenden Arbeit die allgemeingültigen Regeln guter wissenschaftlicher Praxis befolgt zu haben.

Der Autor versichert, dass keine geschützten, beruflichen oder anderweitigen persönlichen Interessen an einem Produkt oder einer Firma bestehen, welche die in dieser Veröffentlichung genannten Inhalte oder Meinungen beeinflussen können.

Nicht zutreffend.

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