Berliner und Münchener Tierärztliche Wochenschrift 123, 243-250

DOI: 10.2376/0005-9366-123-243

© Schlütersche Verlagsgesellschaft mbH & Co. KG. 2010

Publiziert: 05/2010

Zusammenfassung

Zur Pathogeneseforschung caniner neuromuskulärer Erkrankungen ist eine Zellkulturtechnologiezur Gewinnung von Muskelzellen aus Biopsien unter klinischenBedingungen unabdingbar. Ziel der vorliegenden Studie war die Optimierungeines klinisch anwendbaren Protokolls zur Erstellung von Muskelzellprimärkulturen:Durch Verwendung unterschiedlicher Enzyme sollte das Verhältnisin entstehenden Mischkulturen zu Gunsten der Muskelzellen verbessert, dieGesamtausbeute bei einem früheren Einsetzen des Zellwachstums gesteigert unddie Auswirkung einer Transportdauer der Biopsien zwischen ein und drei Tagenfestgestellt werden.
Im Rahmen von Routineoperationen wurden 21 Muskelbiopsien entnommen,jeweils in zwei Portionen zu je 0,2 g aufgeteilt, mechanisch dissoziiert und enzymatischentweder mit Protease oder mit Trypsin aufbereitet. Nach einer Inkubationüber 168 Stunden fand eine immunhistochemische Färbung und Quantifizierungder Myoblasten und Fibrozyten mittels Färbung des Desmins statt. Um denEinfluss der Dauer eines Transportweges zu untersuchen, wurden acht Biopsienjeweils am 1., 2. und 3. Tag nach der Entnahme vergleichend mit Protease undTrypsin angelegt und quantifiziert.
De Auswertung zeigte, dass die Dissoziation mit Protease eine signifikant(P = 0,0102) höhere Ausbeute von Myoblasten und somit eine reinere Kulturerzielte. Mit Protease konnte eine durchschnittliche Myoblastenausbeute von78,96 %, mit Trypsin 52,68 % erreicht werden. Die Proliferation und Differenzierungder mit Protease gewonnenen Myoblasten schritt schneller voran als beiden mit Trypsin gewonnenen Myoblasten.
Somit stellt der Einsatz von Protease bei der Extrahierung von Myoblasten ausMuskelbiopsien eine Optimierung der Primärzellkulturen dar, die als Ausgangsmaterialfür weiterführende Pathogeneseforschung dienen.
Die Dauer des Transportes zeigt keine signifikante (P = 0,798) Abweichung derMyoblastenanzahlen innerhalb der ersten drei Tage, womit eine Verschickung vonBiopsien über weitere Distanzen möglich wird.

Summary

Skeletal muscle cell culture is an important tool to discover the pathogenesis ofrare canine neuromuscular diseases. The aim of the current study was to improvean existing clinical protocol to extract and cultivate canine myoblasts by usingdifferent enzymes for tissue digestion. The contamination of the mixed culturewith fibrocytes should be minimized, a higher number of myoblasts with ashorter lag period should be gained and the influence of transport length on themyoblast numbers should be assessed.
Twenty-one muscle biopsies (n = 21) from healthy dogs were taken, mechanicallytrimmed, enzymatically dissociated with either Protease or Trypsin and culturedunder identical conditions for 168 hours. To distinguish and quantify myoblastsand fibrocytes an immunocytochemical staining of the muscle cell specific intermediatefilament desmin was performed. To analyse the influence of a transporton the samples eight biopsies were cultured with either Trypsin or Protease at thefirst, second and third day after sampling.
Using Protease a significant higher production and a morphological betterproliferation of myoblasts (P = 0.0102) was achieved. The average percentage ofmyoblasts was 78.96 % using Protease and 52.68 % using Trypsin. The duration ofthe transport (1–3 days) did not result in any significant changes in total myoblastcell counts (P = 0.798). This reveals the possibility to send muscle biopsies fromdistant clinics to a specialised laboratory.
In conclusion, the use of Protease is an improvement for cultivating caninemyoblasts and provides better conditions for further investigations elucidatingpathogenesis of rare neuromuscular diseases.