Untersuchungen zur In-vitro-Zytotoxizität und zum Nachweis von Virulenzfaktoren mittels Multiplex-PCR bei Yersinia ruckeri- Isolaten aus Teichwirtschaften in Nord-Westdeutschland

Berliner und Münchener Tierärztliche Wochenschrift 127, 233-242

DOI: 10.2376/0005-9366-127-233

© Schlütersche Verlagsgesellschaft mbH & Co. KG. 2014

Publiziert: 06/2014

Summary

The aim of this study was to investigate differences in presence and expression of virulence factors between biotype 1 and 2 strains of 82 Yersinia (Y.) ruckeri isolates, collected from North West Germany during the period of 2004–2012, and to analyze the cytotoxicity of these strains to different fish cell lines. The common virulence factor genes, such as yhlA and yhlB encoding for hemolysin YhlA, rucC and rupG encoding for ruckerbactin, yrp1 and yrpDEF for ABC exporter protein system, and two flagellar genes, including flgA for flagellar secretion chaperones and flhA for flagellar secretion apparatus, were found present in both biotype 1 and 2 isolates of Y. ruckeri collected from North West Germany using multiplex PCR. mRNA expression of these genes was compared between the two biotypes of Y. ruckeri. There was no significant diversity (p gt; 0.05) in the expression of these genes between biotype 1 and 2 strains. 27 Y. ruckeri isolates from different typing groups were analysed in cytotoxicity tests to common carp brain (CCB), epithelioma papulosum cyprini (EPC), fathead minnow epithelial (FHM) and rainbow trout gonad-2 (RTG-2) cells, respectively. In vitro cytotoxicity of the isolates to CCB, EPC and FHM was higher than that to RTG-2 (p lt; 0.05). At 15°C the maximum cytotoxicity to FHM and EPC was higher in non-motile strains than in motile stains after an incubation of 24 h (p lt; 0.05), however, after 48 h, there was no significant difference (p gt; 0.05) of cytotoxicity between those two biotypes. Our results suggest that biotype 2 strains from North West Germany are homogenous with biotype 1 strains on the basis of genetic virulence factor genes. At lower temperature non-motile Y. ruckeri isolates were found more active than motile strains, which could explain why in winter non-motile strains were found more often responsible for ERM outbreaks than motile strains.

Keywwords
Enteritic red mouth disease, Biotype, cytotoxicity, mRNA expression, Flagellar genes

Zusammenfassung

In der vorliegenden Studie wurden 82 Yersinia (Y.) ruckeri-Isolate, die 2004 bis 2012 von Fischen aus Teichwirtschaften in Nord-Westdeutschland isoliert wurden, auf Vorkommen und Expression von Virulenzfaktoren sowie auf Zytotoxizität gegenüber unterschiedlichen Fischzellen untersucht. Dabei sollten vor allem Unterschiede zwischen Isolaten aus den Biotypen 1 und 2 analysiert werden. Untersucht wurden Gene für beschriebene Virulenzfaktoren: yhlA und yhlB, die das Hämolysin YhlA codieren, rucC und rupG, die das Ruckerbactin codieren, yrp1 und yrpDEF, die Elemente des ABC-Protein-Exkretionssystems codieren, sowie zwei Gene, die Geißel-assoziierte Proteine codieren: flhA, das ein Protein des Geißel-assoziierten Sekretionsapparates codiert, sowie flgA, das ein Geißel-assoziiertes Sekretions-Chaperon codiert. Alle Gene ließen sich in allen untersuchten Isolaten aus Nord-Westdeutschland mittels Multiplex-PCR nachweisen. Zudem wurde die mRNA-Expression dieser Gene bei Isolaten aus beiden Biotypen von Y. ruckeri verglichen. Alle analysierten Gene waren bei den untersuchten Isolaten nicht unterschiedlich exprimiert. Des Weiteren wurden 27 Y. ruckeri-Isolate aus unterschiedlichen Typisierungsgruppen in vitro auf ihre Zytotoxizität auf die Fischzelllinen „common carp brain“ (CCB), Epithelioma papulosum cyprini (EPC), „fathead minnow epithelial cells“ (FHM), und „rainbow trout gonad-2“ (RTG-2) geprüft. Die Mehrzahl der Y. ruckeri-Isolate wies eine geringe In-vitro-Zytotoxizität auf. Die Zytotoxizität war gegenüber den CCB-, EPC- und FHM-Zellen höher als gegenüber RTG-2-Zellen (p lt; 0,05). Bei 15 °C war nach 24 h Inkubation die maximale Zytotoxizität nicht motiler Y. ruckeri-Isolate gegenüber EPC- und FHM-Zellen höher als bei motilen Isolaten (p lt; 0,05). Nach 48 h Inkubationszeit war kein Unterschied zwischen Isolaten aus beiden Biotypen erkennbar. Unsere Ergebnisse lassen vermuten, dass bei Y. ruckeri-Isolaten in Nord-Westdeutschland das Vorkommen von Virulenzfaktoren in beiden Biotypen einheitlich ist. Bei niedrigen Temperaturen scheinen nicht motile Y. ruckeri-Isolate eine höhere Zytotoxizität aufzuweisen, was erklären könnte, warum diese im Winter häufiger für Ausbrüche der Rotmaulseuche verantwortlich waren als motile Isolate.