Vorschlag einer Warnwert-Definition für Haptoglobin und Milch-Amyloid A im Gesamtgemelk und in der Herdensammelmilch

Die subklinische Mastitis ist ein großes Gesundheitsproblem der Milchkühe. Diese Beeinträchtigung der Eutergesundheit führt durch die Verminderung der Milchproduktion und durch die Verschlechterung der Milchqualität zu einschneidenden wirtschaftlichen Verlusten (Huijps et al. 2008). Für die Diagnose der subklinischen Mastitis wird eine Kombination aus der bakteriologischen Untersuchung der Milch und der Ermittlung der Zellzahl in der Milch des betroffenen Euterviertels empfohlen (Hogan et al. 1999). Nach der gebräuchlichen Definition eines gesunden Euterviertels liegen Zellzahlwerte bis 100.000 pro ml im physiologischen Bereich (DVG 2002). Die Differenzierung, wie hoch der Anteil von polymorphkernigen Granulozyten (PMN), Lymphozyten und Makrophagen in der Milchprobe ist, bringt eine genauere Aussage über den Gesundheitszustand der jeweiligen Euterviertel (Sordillo und Streicher 2002). In der Milch eines gesunden Euters mit niedrigen Zellzahlwerten sind hauptsächlich Makrophagen und Lymphozyten enthalten. Im Gegensatz dazu steigt der Anteil der PMN bei einer Infektion und bei einer Erhöhung der Gesamtzellzahl stark an (Paape et al. 2002).

Die Zellzahl in der Herdensammelmilch kann als Kenngröße für die Eutergesundheitssituation der Milchkuhherde verwendet werden. Gemäß einem Vorschlag von Winter (2008a) sollte ein eutergesunder Milchviehbetrieb eine Zellzahl von  150.000 Zellen/ml Herdensammelmilch vorweisen, wobei die Milch aller Tiere in den Tank gemolken und kein Wegmelken der Milch mit hoher Zellzahl durchgeführt wird. Die Firma „ZuchtData“ veröffentlichte 2017 im Jahresbericht einen arithmetischen Mittelwert von 175.484 und einen Medianwert von 61.000 somatischen Zellen in den Gesamtgemelken aller leistungsgeprüften Fleckviehherden (Egger-Danner et al. 2018). Das Fleckvieh ist mit 14.776 Herden die am häufigsten gehaltene, leistungsgeprüfte Rinderrasse in Österreich, gefolgt vom Braunvieh mit 4.207 Herden und den Holstein Friesen mit 3.984 Herden. Daher ist die allgemein übliche Zellzahlgrenze von 200.000 Zellen/ml im Gesamtgemelk für die Rasse Fleckvieh als Kriterium für eine frühzeitige Detektion von subklinischen Mastitiden nicht anwendbar (Hofrichter et al. 2010). Zur Zählung der PMN in den Milchproben wurden schon sehr früh Durchflusszytometer eingesetzt (Rivas et al. 2001, Schwarz et al. 2011a). Ein Grenzwert von 0,495 – errechnet aus dem Verhältnis der logarithmierten Zahl der PMN und der logarithmierten Zahl der Lymphozyten – wird zur Unterscheidung von gesunden und kranken Eutervierteln verwendet (Pilla et al. 2013). Die Firma Foss entwickelte ein Gerät, das 600 Proben pro Stunde analysiert und die Anzahl der PMN sowie die Anzahl der Lymphozyten bestimmen kann, um eine Entzündung des Euters festzustellen (FOSS 2017).

Technisch weniger aufwendig ist die quantitative Bestimmung der „Akute-Phase-Proteine“ (APP). Die Entzündungsindikatoren sind eine mögliche Alternative zur Zählung der PMN und der Lymphozyten (Pyörälä et al. 2011). Die APPs werden sowohl in der Leber, als auch in anderen Geweben, wie z. B. im Euter, gebildet und sind ein vielversprechender Biomarker für die Diagnose einer subklinischen Mastitis (Grönlund et al. 2005). Beim Rind sind Haptoglobin (Hp) und Serum-Amyloid A (SAA) die wichtigsten APP. Die Isoform 3 des Serum-Amyloid A (M-SAA3) wird in den Epithelzellen des Euters nach einer Stimulierung durch Lipopolysaccharide gebildet (Larson et al. 2005).
Auch nach Stimulierung durch Lipoteichonsäure von Staphylococcus aureus bildeten die Epithelzellen des Euters bovines M-SAA3 (Weber et al. 2006). Hp und SAA werden in der Leber gebildet und gelangen über den Blutstrom in das Euter. Im Gegensatz dazu wird M-SAA3 lokal im Euter gebildet und als Indikator für Mastitiden angesehen (Eckersall et al. 2001, 2006). Die Epithelzellen der Euteralveolen bilden nach einer Infektion mit Escherichia coli ebenfalls Hp, das nicht aus der Leber stammt (Thielen et al. 2007). Mit quantitativen ELISA-Methoden können sowohl M-SAA3- als auch Hp-Konzentrationen in Milchproben festgestellt werden (BioX 2018, Tridelta 2018). Die ELISA-Methoden ermöglichen eine rasche Untersuchung vieler Proben. In dieser Arbeit sollen Warnwerte für M-SAA3 und Hp im Gesamtgemelk erarbeitet werden, anhand derer unterschieden werden kann, ob die Milch von einem gesunden oder subklinisch erkrankten Euter stammt. Um M-SAA3 und Hp für Screening-Untersuchungen in Herdensammelmilchproben verwenden zu können, wurden Warnwerte festgesetzt, ab denen ein Anteil von 30 %, 40 % bzw. 50 % der Milchkühe einer Herde den Warnwert für die einzelnen Gesamtgemelke überschreitet.

Um den Zusammenhang der APP-Konzentrationen zwischen den gepoolten und den tatsächlichen Gesamtgemelken zu bestimmen, wurde von 26 Kühen aus zwei Betrieben beim Melken die Milchmenge jedes Euterviertels mittels Messzylinder ermittelt. Vor dem Melken wurde aus jedem Euterviertel eine Milchprobe für die bakteriologische Untersuchung entnommen. Diese Proben wurden auch zur Herstellung von gepoolten Gesamtgemelken der Kühe verwendet. Nach dem Melken wurde die Milch jeder Kuh aus den Messzylindern zusammengeführt und von jedem tatsächlichen Gesamtgemelk eine Probe zur APP-Bestimmung entnommen.

Die Milchproben der Euterviertel von Kühen (Viertelgemelksproben) und die Herdensammelmilchproben wurden von den Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Niederösterreichischen Landeskontrollverbandes gesammelt. Die Viertelgemelksproben stammten von 298 Milchkühen aus 61 niederösterreichischen Herdbuch-Zuchtbetrieben. Davon wurden 162 Kühe einmal, 68 Kühe zweimal, 53 Kühe dreimal, neun Kühe viermal, zwei Kühe fünfmal und vier Kühe sechsmal beprobt. Der mittlere Abstand der Probenziehungen betrug 51,4 Tage. Von 298 Kühen, die insgesamt 527-mal beprobt wurden, konnten jedoch nur 2.096 Viertelgemelksproben erhalten werden, da zehn Kühe nur drei und eine Kuh nur zwei laktierende Euterviertel hatten. Das jeweilige Gesamtgemelk einer Kuh wurde durch das Zusammenführen gleicher Teile der jeweiligen Viertelgemelksproben im Labor des Vereins zur Förderung der veterinärmedizinischen Laboruntersuchung hergestellt (gepoolte Gesamtgemelke).

Eine Anzahl von 30 weiteren Sammelmilchproben und die in den Milchtank eingeleiteten Gesamtgemelke von 678 Kühen der jeweiligen Betriebe mit sieben bis 70 melkenden Kühen wurden gleichfalls von den Mitarbeitern und Mitarbeiterinnen des Landeskontrollverbandes gesammelt.

In einer weiteren Anzahl von 437 Herdensammelmilchproben aus Niederösterreichischen Milchviehbetrieben wurde die Konzentration der angeführten APP bestimmt. Die Bestimmung des Gehalts an somatischen Zellen pro Milliliter Milch der Gesamtgemelke wurde im Qualitätslabor Gmünd durchgeführt. Aus den arithmetischen Mittelwerten aller Zellzahlen der einzelnen Kühe wurde unter Berücksichtigung ihrer Milchleistung vom Landeskontrollverband die jeweilige Zellzahl der Herdensammelmilch errechnet.

Die mikrobiologische Untersuchung der Viertelgemelksproben wurde analog dem „Praktischen Leitfaden Mastitis: Untersuchung im Labor“ durchgeführt (Winter 2008c).
Die aus den Viertelgemelksproben isolierten Erreger wurden in „stark pathogene“ und „schwach pathogene“ eingeteilt (Djabri et al. 2002).

Zur Bestimmung der Konzentration der Isoform 3 des Serum-Amyloid A (M-SAA3) in Mikrogramm pro Milliliter (µg/ml) in den Milchproben wurde der „Phase“^TM Milch-Amyloid A (M-SAA3) ELISA Kit der Firma Tridelta gemäß den Angaben des Herstellers verwendet. Der Arbeitsbereich des M-SAA3-ELISA liegt zwischen den Konzentrationen von 0,001 und 7,5 µg/ml Milch. Die Proben, deren Konzentration an M-SAA3 höher ist als der Standard mit der höchsten Konzentration, sind stärker zu verdünnen (Tridelta 2018). Die Wiederholbarkeit innerhalb einer ELISA-Platte, ausgedrückt durch den Variationskoeffizienten in Prozent, beträgt laut Hersteller 6,6 %. Zwischen den ELISA-Platten wird vom Hersteller ein Variationskoeffizient von 9,9 % angegeben. Die Konzentration von Haptoglobin (Hp) in Mikrogramm pro Milliliter (µg/ml) Milch wurde mit dem „Monoscreen Bovine Haptoglobin ELISA-KIT“ der Firma BioX gemäß den Angaben des Herstellers ermittelt. Der Arbeitsbereich des Hp-ELISA liegt zwischen den Konzentrationen von 0,0056 und 1,8 µg/ml Milch. Dieser Arbeitsbereich entsprach den Konzentrationen (0,005–1,8 µg/ml), die der Hersteller für die Kalibrierung der verwendeten ELISA-Version zur Verfügung stellte (BioX 2018). Die Proben, deren Konzentration an Hp höher ist als der Standard mit der höchsten Konzentration, sind stärker zu verdünnen. Die Wiederholbarkeit innerhalb einer ELISA-Platte, ausgedrückt durch den Variationskoeffizienten, beträgt laut Hersteller 2,4 %. Zwischen den ELISA-Platten wird vom Hersteller ein Variationskoeffizient von 6,6 % angegeben.

Zur Bestimmung des Zusammenhangs wurden die M-SAA3- und die Hp-Konzentrationen der Viertelgemelksproben, sowie die M-SAA3- und die Hp-Konzentrationen der dazugehörigen Gesamtgemelke ermittelt. Das arithmetische Mittel der M-SAA3- und der Hp-Konzentrationen der Viertelgemelksproben wurde mit den ermittelten Werten aus dem Gesamtgemelk verglichen. Der Arbeitsbereich des M-SAA3-ELISA endet bei einer Konzentration von 7,5 µg/ml und der des Hp-ELISA bei 1,8 µg/ml, Es wurden daher nur jene Proben berücksichtigt, deren Werte aus allen vier Viertelgemelksproben und der jeweiligen Gesamtgemelke im Arbeitsbereich der ELISA-Kits lagen.

Für die Berechnung der Warnwerte für M-SAA3- oder Hp-Konzentrationen, ab welchen eine Kuh als potenziell infiziert einzustufen ist, wurden die M-SAA3- und die Hp-Konzentration des Gesamtgemelks und das Ergebnis der bakteriologischen Viertelgemelksuntersuchung herangezogen. Aufgrund des Ergebnisses der bakteriologischen Untersuchung wurde jede Kuh in eine von drei Kategorien eingeordnet. In die Kategorie der „nicht infizierten Kühe“ sind die Kühe einzuordnen, aus deren Viertelgemelksproben keine pathogenen Keime isoliert werden konnten. Die Kategorie „infizierte Kühe“ wurde in zwei weitere Kategorien unterteilt. Wurde bei einer Kuh ein stark pathogener Erreger zumindest aus einem Euterviertel isoliert, kam sie in die Kategorie „infiziert mit stark pathogenem Erreger“. Konnte bei einer Kuh nur ein schwach pathogener Erreger isoliert werden, kam sie in die Kategorie „infiziert mit schwach pathogenem Erreger“. Diese Einteilung wurde gewählt, da Jaeger et al. (2017) beschrieben haben, dass die M-SAA3-Konzentration in der Milch bei Kühen, die mit stark pathogenen Erregern infiziert sind, höher ist.

Stark pathogene Erreger sind: Stapylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., Escherichia coli, Citrobacter spp., Klebsiella spp.

Schwach pathogene Erreger sind: Koagulasenegative Staphylokokken, Bacillus spp., Corynebacterium spp.

Für die Bestimmung der Warnwerte für die M-SAA3- und die Hp-Konzentration zur Einteilung in die drei Gruppen („nicht infiziert“, „infiziert mit schwach pathogenem Erreger“, „infiziert mit stark pathogenem Erreger“) wurde der Ansatz des „Model-based Clustering“ gewählt. Die Berechnungen erfolgten mit dem „R-Package mclust“ (Scrucca et al. 2016). Dabei wird von der Annahme ausgegangen, dass die beobachteten M-SAA3- und Hp-Konzentrationen aus Normalverteilungen mit unterschiedlichem Erwartungswert und unterschiedlicher Varianz stammen, je nachdem, ob es sich um eine nicht infizierte Milchkuh oder eine infizierte Milchkuh handelt. Bei nicht infizierten Milchkühen sollte die beobachtete M-SAA3- und Hp-Konzentration mit einer geringen Streuung nahe um Null verteilt sein. Im Gegensatz dazu sind bei infizierten Milchkühen eine höhere oder mittlere Konzentration der APP und eine größere Streuung um diese Konzentration zu erwarten. Eventuell gibt es auch einen Unterschied in der Verteilung zwischen den mit „schwach bzw. stark pathogenen Erregern“ infizierten Milchkühen. Ziel ist es daher, die beobachteten M-SAA3- und Hp-Konzentrationen in Gruppen einzuteilen und dann zu überprüfen, inwiefern diese Gruppen mit dem Infektionsstatus („nicht infiziert“, „infiziert mit schwach pathogenen Erregern“, „infiziert mit stark pathogenen Erregern“) der Milchkühe übereinstimmen. Es wird hier angenommen, dass die Konzentrationen in jeder Gruppe aus einer Normalverteilung stammen. Ziel ist es somit, für jede dieser Gruppen den Erwartungswert und die Varianz für diese Normalverteilungen zu bestimmen. Der Algorithmus ist so aufgebaut, dass er automatisch bestimmt, wie viele solcher Gruppen notwendig sind, um die beobachteten M-SAA3- und Hp-Konzentrationen mit diesen Verteilungen pro Gruppe gut zu beschreiben. Diese Aufteilung der M-SAA3- und Hp-Konzentrationen in verschiedene Gruppen liefert zusätzlich Grenzen zwischen den einzelnen Gruppen. Bei einer guten Übereinstimmung der durch das Model-based Clustering gefundenen Gruppen mit den definierten Gruppen: „nicht infiziert“, „infiziert mit schwach pathogenen Erregern“ bzw. „infiziert mit stark pathogenen Erregern“ können diese Grenzen herangezogen werden, um zu entscheiden, welche Milchkühe potenziell infiziert sind.

Um den Anteil der potenziell infizierten Milchkühe des Bestandes zu erkennen, wurden in 30 milchliefernden Betrieben die M-SAA3- und Hp-Konzentration der Herdensammelmilchproben und der Gesamtgemelke der Milchkühe bestimmt, deren Milch im Milchtank des Betriebes gesammelt wurde. Für die Einstufung, ob eine Milchkuh positiv ist, wurden die M-SAA3- bzw. die Hp-Konzentrationen mit den dazugehörenden Warnwerten von 0,38 µg/ml für M-SAA3 und 0,21 µg/ml für Hp herangezogen. Pro Betrieb wurde der Anteil der Milchkühe berechnet, deren M-SAA3- bzw. Hp-Konzentration des jeweiligen Gesamtgemelkes über dem Warnwert lag. Für die Beurteilung, ab welchem Anteil eine Herdensammelmilchprobe als positiv gewertet wird, wurden drei Varianten gewählt: Betriebe mit einem Anteil von 30, 40 und 50 % der Milchkühe, deren M-SAA3- bzw. deren Hp-Konzentration über dem Warnwert für die Gesamtgemelke lag. Die Prozentsätze wurden ausgewählt, um die Sensitivität der Methode zu erarbeiten.
Für die Analyse wurden zwei Modellansätze herangezogen, eine logistische Regression und ein „generalisiertes lineares Modell“ (GLM) mit der Annahme einer gammaverteilten Zielgröße. Für die Berechnungen wurde die „open source software R for statistical computation“ verwendet (R Core Team 2019). Die Zielgröße war der Anteil der Milchkühe pro Betrieb, deren M-SAA3- bzw. Hp-Konzentration über dem Warnwert für die Gesamtgemelke lag, wobei die Anzahl der Milchkühe pro Betrieb als Gewichtungsfaktor berücksichtigt wurde. Anhand der Modelle lässt sich dann der Anteil der Milchkühe pro Betrieb abschätzen, deren M-SAA3- bzw. Hp-Konzentration über dem Warnwert für die Gesamtgemelke lag. Umgekehrt kann anhand des geschätzten Anteils an positiven Milchkühen pro Betrieb (30, 40 und 50 %) die dazugehörige M-SAA3- bzw. Hp-Konzentration aus dem Modell abgelesen werden. Diese repräsentiert den Warnwert für die jeweilige Annahme von 30, 40 und 50 %. Die Warnwerte für die Herdensammelmilch wurden in einem weiteren Schritt herangezogen, um einen Betrieb als „nicht verdächtig“ bzw. „verdächtig“ zu bewerten. Diese Bewertung wurde mit der tatsächlichen Einteilung verglichen. Für die Beurteilung der Qualität der Vorhersage wurden folgende Kennzahlen herangezogen:

• Genauigkeit – Anteil der richtigen Vorhersage von negativen und positiven Betrieben
• Cohen’s Kappa – Maß für die Übereinstimmung zwischen Vorhersage und tatsächlichem Wert; dieses Maß liegt zwischen 0 und 1; je näher es bei 1 liegt, desto besser ist die Übereinstimmung
• Sensitivität, Spezifität, positiver und negativer Vorhersagewert

In 437 Herdensammelmilchproben wurde die jeweilige Hp- und M-SAA3-Konzentration bestimmt. Es wurden nur jene Proben berücksichtigt, bei denen die Hp-Konzentration ≤ 1,8 µg/ml und die M-SAA3-Konzentration ≤ 5 µg/ml Milch waren.

Die in Tabelle 1 aufgelisteten Milchmengen der einzelnen Euterviertel zeigen erhebliche Unterschiede in den Milchmengen der einzelnen Viertel. Die bakteriologische Untersuchung der Viertelgemelksproben ergab folgende Ergebnisse: In 19 Eutervierteln konnten „schwach pathogene Erreger“ (koagulasenegative Staphylokokken, Corynebacterium spp.) und in 14 Eutervierteln der 26 Kühe „stark pathogene Erreger“ (Stapylococcus aureus, Streptococcus uberis) nachgewiesen werden (Tab. 1).
Die Bestimmung der M-SAA-3-Konzentration in den Gesamtgemelken ergab bei drei Kühen (Nr. 16, 19, 21) einen Wert über 7,5 µg/ml. Diese Werte der Kühe wurden für die Berechnung der Korrelation nicht verwendet. Ein Korrelationskoeffizient zwischen den M-SAA-3-Konzentrationen der tatsächlichen und gepoolten Gesamtgemelke wurde bei 23 Kühen berechnet und ergab einen Wert von 0,854.

Die Bestimmung der Hp-Konzentration in den tatsächlichen und in den gepoolten Gesamtgemelken ergab bei den Kühen Nr. 16, 21 und 22 im Gesamtgemelk eine Konzentration über 1,8 µg/ml. Diese Kühe wurden für die Berechnung der Korrelation zwischen tatsächlichem und gepooltem Gesamtgemelk nicht verwendet. Ein Korrelationskoeffizient zwischen den Hp-Konzentrationen der tatsächlichen und der gepoolten Gesamtgemelke wurde bei 23 Kühen berechnet und ergab einen Wert von 0,84.

Insgesamt wurden 2.096 Viertelgemelksproben bakteriologisch untersucht und die Isolate anhand der Ergebnisse in „schwach pathogene, stark pathogene und nicht klassifizierte Isolate“ eingeteilt. Bei 1.362 (64,98 %) Proben war kein Erreger isolierbar. In 312 Proben (14,89 %) konnten „stark pathogene Erreger“ und in 346 Proben (16,51 %) „schwach pathogene Erreger“ nachgewiesen werden. Die Proben mit zwei Isolaten und zumindest einem „stark pathogenen“ Erreger wurden nur der Kategorie infiziert mit „stark pathogenen“ Erregern zugeordnet. Die Proben, bei denen zwei „schwach pathogene“ Erreger isoliert wurden, kamen in die Kategorie infiziert mit „schwach pathogenen“ Erregern. Die Isolate weiterer 76 Proben (3,63 %) wurden nicht klassifiziert (Tab. 2).

Abbildung 1 zeigt den Zusammenhang zwischen der M-SAA3-Konzentration des jeweiligen Gesamtgemelks und der M-SAA3-Konzentration, errechnet durch das arithmetische Mittel der Ergebnisse der Viertelgemelke. Es ist zu erkennen, dass die Variabilität um die Trendlinie umso größer ist je höher die jeweilige M-SAA3-Konzentration in den Gesamtgemelksproben ist. Eine Bedingung für das Anwenden der linearen Regression ist eine konstante Variabilität um die Gerade. Um dies zu erreichen, wird sowohl für die abhängige Variable, das jeweilige arithmetische Mittel der Ergebnisse der Viertelgemelksproben, als auch für die erklärende Variable, die Ergebnisse aus dem Gesamtgemelk, die Quadratwurzel der Werte verwendet. Für diese transformierten Variablen wird eine lineare Regression geschätzt und die Ergebnisse werden wieder zurück transformiert. Die resultierende Funktion daraus ist µ = 0,018 + 0,122 √x + 0,822x mit einem Bestimmtheitsmaß von 0,86. Die angepasste Funktion ist in Abbildung 1 als durchgehend schwarze Linie eingezeichnet.

Abbildung 2 zeigt den Zusammenhang zwischen der Hp-Konzentration des jeweiligen Gesamtgemelks und der Hp-Konzentration, errechnet durch das arithmetische Mittel der Ergebnisse der Viertelgemelke. Es wurden nur Proben aus dem Arbeitsbereich von 0,005–1,8 µg/ml betrachtet. Es gibt einen klaren linearen Zusammenhang mit µ = 0,021 + 0,87x und einem Bestimmtheitsmaß von 0,93. Diese Funktion ist in Abbildung 2 als durchgehend schwarze Linie eingezeichnet.

Die ermittelten M-SAA3- und Hp-Konzentrationen in den Gesamtgemelken werden für die Berechnung von Warnwerten verwendet, anhand derer eine Unterscheidung in „nicht infizierte“ und „infizierte“ Milchkühe getroffen werden kann. Sowohl bei den M-SAA3-Werten als auch bei den Hp-Werten wurde der Ansatz des „Model-based Clustering“ verwendet, um die Werte in Gruppen einzuteilen. Auch hier wurde für die Analyse die Quadratwurzel beider Variablen als Datengrundlage herangezogen. Für die M-SAA3-Werte liefert die Methode eine optimale Lösung mit drei Gruppen. Diese drei Gruppen können als die drei Kategorien „nicht infiziert“, „mit schwach pathogenem Erreger infiziert“ und „mit stark pathogenem Erreger infiziert“ interpretiert werden.

Auch für die Hp-Werte ergibt sich eine optimale Einteilung in drei Gruppen. Die daraus resultierenden Warnwerte für die Einteilung in die drei Kategorien sind in Tabelle 3 aufgelistet.

Anhand des „model-based clustering“ ergibt sich somit für die M-SAA3-Konzentration eine Grenze von 0,38 µg/ml, um zwischen nicht infizierten und infizierten Tieren zu unterscheiden. Bei den Hp-Werten liegt diese Grenze bei 0,21 µg/ml. Die daraus resultierenden Kennzahlen für die Vergleichbarkeit der Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgelistet.

Durch definierte M-SAA3- und Hp-Werte der Herdensammelmilch sollen Betriebe mit einem erhöhten Anteil an infizierten Milchkühen identifizierbar sein. Es wird jeweils der Zusammenhang zwischen den Ergebnissen aus der Herdensammelmilch und dem Anteil der potenziell infizierten Milchkühe pro Betrieb betrachtet. Es wird ein Anteil von 30, 40 und 50 % der Milchkühe einer Herde betrachtet, in welchem die M-SAA3-Werte der einzelnen Milchkühe über 0,38 µg/ml und die Hp-Werte der einzelnen Milchkühe über 0,21 µg/ml lagen.

Für die M-SAA3-Werte beschreibt eine logistische Regression den Zusammenhang am besten. Die Daten mit der angepassten Kurve sind in Abbildung 3 dargestellt. Für die drei Varianten (30, 40 und 50 %) können somit anhand der Schnittpunkte mit der angepassten Modellkurve Warnwerte für die M-SAA3-Konzentration in der Herdensammelmilch bestimmt werden. Diese sind mit den dazugehörigen Kennzahlen in Tabelle 5 aufgelistet.

Es ergibt sich für die Variante mit einem Anteil von 40 % potenziell infizierter Milchkühe in einer Herde, die den Warnwert im jeweiligen Gesamtgemelk von 0,38 µg/ml überschreiten, ein M-SAA3-Warnwert in der Herdensammelmilch von 0,69 µg/ml.

Bei der Modellierung der Hp-Werte liefert ein GLM mit gammaverteilter Zielgröße die besten Ergebnisse. Die Daten mit der eingezeichneten angepassten Funktion sind in Abbildung 4 zu sehen. Die Warnwerte für die einzelnen Varianten sind in Tabelle 6 aufgelistet. Für die Variante mit einem Anteil von 40 % potenziell infizierten Milchkühen in der Herde, also Kühen, die den Warnwert im jeweiligen Gesamtgemelk von 0,21 µg/ml überschreiten, ergibt sich ein Warnwert in der Herdensammelmilch von 0,38 µg/ml (Tab. 6).

Der Zusammenhang zwischen der M-SAA3- und der Hp-Konzentration in der Herdensammelmilch ist in Abbildung 5 dargestellt. Beide Achsen wurden mit der Quadratwurzel skaliert, um den Zusammenhang besser darzustellen. Der Korrelationskoeffizient der Quadratwurzel aus beiden Konzentrationen beträgt 0,63 (Abb. 5).

Abbildung 6 zeigt den Zusammenhang zwischen der M-SAA3-Konzentration und der Anzahl an somatischen Zellen. Die x-Achse wurde mit der Quadratwurzel und die y-Achse mit dem log10 skaliert. Ein nicht linearer Zusammenhang ist erkennbar. Bei einer Anzahl von 150.000 Zellen pro ml Herdensammelmilch ist eine horizontale Linie und beim Warnwert von 0,69 µg/ml für M-SAA3 ist eine vertikale Linie eingezeichnet (Abb. 6). Der Zusammenhang zwischen der Hp-Konzentration und der Anzahl an somatischen Zellen, wird in Abbildung 7 dargestellt. Auch in dieser Abbildung wurden die x-Achse mit der Quadratwurzel und die y-Achse mit dem log10 skaliert. Und auch hier ist ein nicht linearer Zusammenhang erkennbar. Die horizontale Linie markiert die Anzahl von 150.000 somatischen Zellen pro ml Herdensammelmilch und die vertikale Linie ist bei 0,38 µg/ml, dem Warnwert für Hp in der Herdensammelmilch, eingezeichnet (Abb. 7).

Für diesen Vergleich wurden der erarbeitete M-SAA3-Warnwert von 0,69 µg/ml und der Hp-Warnwert von 0,38 µg/ml für die Herdensammelmilch herangezogen und mit einer Zellzahl von 150.000 somatischen Zellen pro ml Herdensammelmilch bei einer Anzahl von 437 Herdensammelmilchproben verglichen. In Tabelle 7 ist die Häufigkeitsverteilung der Herdensammelmilchproben mit M-SAA3-Konzentrationen, die größer oder kleiner als 0,69 µg/ml sind, dargestellt. Sie wird mit den Herdensammelmilchproben verglichen, die eine höhere oder geringere Anzahl als 150.000 somatische Zellen pro ml aufweisen. Eine Anzahl von 154 Herdensammelmilchproben hatte mehr als 150.000 Zellen pro ml, jedoch nur 39 wiesen eine M-SAA3-Konzentration auf, die höher als 0,69 µg/ml war. Insgesamt waren bei 52 Herdensammelmilchproben M-SAA3-Konzentrationen von über 0,69 µg/ml nachweisbar (Tab. 7).

In Tabelle 8 ist die Häufigkeitsverteilung der Herdensammelmilchproben mit Hp-Konzentrationen, die größer oder kleiner als 0,38 µg/ml sind, abgebildet und wird mit den Herdensammelmilchproben verglichen, die eine größere oder geringere Anzahl als 150.000 somatische Zellen pro ml aufwiesen. Eine Anzahl von 154 Herdensammelmilchproben hatte mehr als 150.000 Zellen pro ml und 121 davon wiesen eine Hp-Konzentration auf, die höher als 0,38 µg/ml war. Insgesamt waren bei 203 Herdensammelmilchproben Hp-Konzentrationen über 0,38 µg/ml nachweisbar (Tab. 8).

Um die einzelnen Methoden zu vergleichen, sind in Tabelle 9 Kennzahlen aufgelistet. Die Genauigkeit der Hp-Methode beträgt 0,737 und die der M-SAA3 0,707. Ein Unterschied besteht bei Cohen’s Kappa zwischen der Hp-Methode (0,462) und der M-SAA3-Methode (0,244). Ein weiterer Unterschied wurde bei der Sensitivität (Hp [0,79], M-SAA3 [0,25]) festgestellt (Tab. 9).

Ein Korrelationskoeffizient zwischen den Hp- und den M-SAA3-Konzentrationen der tatsächlichen und der gepoolten Gesamtgemelke (Hp: 0,84; M-SAA3: 0,854) wurde bei 23 Kühen berechnet. Sowohl bei Hp als auch bei M-SAA3 stimmen die Konzentrationen in den tatsächlichen und den gepoolten Gesamtgemelken gut überein. Die Verwendung von gepoolten Gesamtgemelken für weitere Analysen und Berechnungen wird damit als möglich erachtet. Die Herstellung eines gepoolten Gesamtgemelks aus den Viertelgemelken, die oft als bakteriologische Milchproben vorliegen, ist auch einfacher als die Gewinnung eines tatsächlichen Gesamtgemelkes.

Die Abbildungen 1 und 2 zeigen den Zusammenhang zwischen der M-SAA3- bzw. der Hp-Konzentration des jeweiligen Gesamtgemelks und der Konzentration, errechnet durch das arithmetische Mittel der zugehörigen Ergebnisse der Viertelgemelke.

Beide Modelle zeigen, dass die Konzentrationen des Gesamtgemelks gut geeignet sind, um die Ergebnisse der Viertel darzustellen.

Für die M-SAA3-Konzentration wurde eine Grenze von 0,38 µg/ml in der Milch des Gesamtgemelks für alle Mastitiserreger festgelegt, um zwischen nicht infizierten und infizierten Tieren zu unterscheiden. Bei den Hp-Werten liegt diese Grenze bei 0,21 µg/ml in der Milch des Gesamtgemelks für alle Mastitiserreger. Gemäß dem Konzept von Jaeger et al. (2017) wurden für „stark pathogene Mastitiserreger“ und „schwach pathogene Mastitiserreger“ eigene Warnwerte für M-SAA3 in deren Arbeit definiert. Pyörälä und Taponen (2009) berichteten jedoch über persistente Infektionen, hervorgerufen von koagulasenegativen Staphylokokken (Staphylococcus simulans, Staphylococcus chromogenes), die zu Gewebezerstörung des Euters, Zellzahlanstieg und Milchverlust führten. Naushad et al. 2019 untersuchten 83 Isolate von Staphylococcus chromogenes mit gentechnischen Methoden, von denen 23 eine klinische Mastitis verursacht hatten. Die vorgeschlagene Einteilung in „stark pathogene Mastitiserreger“ und „schwach pathogenen Mastitiserreger“ wird dadurch relativiert. Jaeger et al. (2017) beschrieben für „stark pathogene Mastitiserreger“ Medianwerte der M-SAA3-Konzentrationen von 8,19 µg/ml Milch (Staphylococcus aureus) oder 6,27 µg/ml Milch (Streptococcus uberis). Die „schwach pathogenen Mastitiserreger“ erzeugten nur Medianwerte der M-SAA3-Konzentrationen von 3,24 µg/ml in der Milch. In den „sterilen Gesamtgemelksproben“, in denen die Anzüchtung eines pathogenen Mastitiserregers nicht möglich war, wurden Medianwerte der M-SAA3-Konzentrationen von 1,28 µg/ml Milch ermittelt. Die Autoren definierten mit der „latenten Klassenanalyse“ einen M-SAA3-Grenzwert von 3,9 µg/ml Milch, um Infektionen mit „stark pathogenen Mastitiserregern“ festzustellen. Um Infektionen auch mit „schwach pathogenen Erregern“ zu erkennen, definierten Jaeger et al. (2017) einen M-SAA3-Grenzwert von 1,6 µg/ml Milch. Die höheren Medianwerte, im Vergleich zu anderen Autoren, wären durch die nicht vollständige Standardisierbarkeit der bakteriologischen Milchuntersuchung, die als Goldstandard angesehen wird und trotzdem ihre Schwächen aufweist, erklärbar (Hiitiö et al. 2015). Bradley et al. (2008) berichten über einen Anteil von 39 % der Viertelgemelksproben mit hohen Zellzahlen, in denen die Anzüchtung von Erregern nicht möglich war. Akerstedt et al. (2007, 2011) beschreiben für die verwendeten Testsysteme untere Detektionsgrenzen von 1 µg/ml für Hp und 0,3 µg/ml für M-SAA3. Der Vergleich der Zahl an somatischen Zellen pro Milliliter Milch der einzelnen Gesamtgemelke von 89 Kühen mit den jeweiligen Konzentrationen der APPs (Hp, M-SAA3) ergab einen signifikanten Zusammenhang. Ein vergleichbarer Wert von 0,3 µg/ml Milch für Hp wurde von Grönlund et al. (2005) beschrieben, indem die Hp- und M-SAA3-Konzentrationen mit dem Ergebnis der bakteriologischen Milchuntersuchung verglichen wurden. Bei einem mittleren Wert für Hp von 0,3 µg/ml konnten nur bei 1 % der Proben Mastitiserreger isoliert werden. Im Gegensatz dazu wurden bei einem mittleren Wert von 1 µg/ml Hp bereits bei 5 % der Proben Mastitiserreger diagnostiziert (Grönlund et al. 2005). Kalmus et al. (2013) berichten über die Aktivität von M-SAA3, Hp und N-acetyl-β-D-Glucosaminidase bei Kühen mit klinischer Mastitis, deren Erreger sie mit einer quantitativen Polymerase-Kettenreaktion feststellten. Bei größeren Mengen von erregerspezifischen Nukleinsäuren wurden auch höhere Hp-Konzentrationen diagnostiziert. Sie schlossen daraus, dass Hp ein besserer Indikator als M-SAA3 für eine Mastitis sein könnte.

Für die Variante mit einem Anteil von 40 % potenziell infizierter Milchkühe, deren Milch in der Herdensammelmilch enthalten ist, konnte ein M-SAA3-Warnwert in der Herdensammelmilch von 0,69 µg/ml und ein Hp-Warnwert von 0,38 µg/ml ermittelt werden.

Die Genauigkeit der Übereinstimmung des M-SAA3-Warnwerts in der Herdensammelmilch ist allerdings mit 67 % mittelmäßig und auch Cohen’s Kappa von 0,25 weist auf eine sehr geringe Übereinstimmung hin. Für die anderen beiden Varianten sind die Ergebnisse etwas besser, allerdings ist bei der 30 % Variante die Spezifität mit 37,5 % sehr gering.

Die besten Ergebnisse erzielt die 40 % Variante mit einem Warnwert von 0,38 µg/ml Hp für die Herdensammelmilch. Die Genauigkeit liegt bei dieser Variante bei 87 % und das Cohen’s Kappa von 0,71 weist auf eine gute Übereinstimmung hin. Auch die Sensitivität und Spezifität sowie die positiven und negativen Vorhersagewerte sind deutlich besser als bei den Ergebnissen mit den M-SAA3-Werten. Somit liefert die Variante mit den Hp-Werten aus der Herdensammelmilch mit einem Warnwert von 0,38 µg/ml die besten Ergebnisse. Damit ist ein Betrieb mit mehr als 40 % infizierter Milchkühe, deren Gesamtgemelke eine Hp-Konzentration > 0,21 µg/ml aufweisen, gut erkennbar.
Akerstedt et al. (2007), die sich mit Hp- und M-SAA3-Bestimmungen in Herdensammelmilch beschäftigten, berichten über einen Anteil von 82 % der Herdensammelmilchproben, in denen M-SAA3 gefunden werden konnte. Die durchschnittliche M-SAA3-Konzentration betrug dabei 2,0 ± 1,5 µg/ml. In 41 % der Proben war Hp mit einer durchschnittlichen Konzentration von 1,5 ± 0,6 µg/ml messbar. Für die Bestimmung der Hp-Konzentration wurde kein ELISA verwendet, sondern ein eigener Biosensor Assay, der Hp-Konzentrationen unter 1 µg/ml nicht detektiert.

Zwischen der Hp-Konzentration und der Anzahl der somatischen Zellen besteht ein nicht linearer Zusammenhang (Abb. 7). Und auch zwischen der M-SAA3-Konzentration und der Anzahl an somatischen Zellen ist ein nicht linearer Zusammenhang ersichtlich (Abb. 6), der aber deutlich schwächer ist als der Zusammenhang zwischen der Hp-Konzentration und der Anzahl der somatischen Zellen in der Herdensammelmilch. Auch die Werte streuen stärker als bei der Hp-Konzentration.

Von einem signifikanten Zusammenhang zwischen der Zellzahl der Herdensammelmilch und der M-SAA3-Konzentration berichteten Akerstedt et al. (2007). Lai et al. (2009) beschrieben, dass bei einer Mastitis und einer Erhöhung der Zellzahl in der Milch für die Biosynthese und Freisetzung von Hp die PMN und die Epithelzellen der Milchdrüse hautverantwortlich sind. Die PMN werden durch Zytokine (Interleukine: IL-1β, IL-6, IL-8; Tumornekrosefaktor-α) aktiviert, um aus Blut- und Lymphgefäßen in die Alveolen des Eutergewebes zu wandern, wo die Freisetzung von Hp aus den PMN erfolgt. Je höher die Zahl der somatischen Zellen in der Milch und der Anteil der PMN ist, desto höhere Hp-Konzentrationen konnten von Lai et al. (2009) ermittelt werden. Dieser Zusammenhang zwischen der Zellzahl und der Hp-Konzentration konnte, wie in Abbildung 7 dargestellt, auch in der Herdensammelmilch festgestellt werden, obwohl der Zusammenhang nicht linear ist.

Die Überwachung der Eutergesundheit eines Einzeltieres oder der Herde durch die Zellzahlbestimmung ist seit langer Zeit eingeführt und wird sicher unverzichtbar bleiben (Phipps und Newbould 1965, Schalm und Noorlander 1957, Schmidt-Madsen 1975). Ökonomische Gründe sprechen dafür, da die Milchprüflabore die Zellzahlbestimmung für Großkunden um durchschnittlich 0,4 Euro pro Probe anbieten. Die Bestimmung der APPs mit den beschriebenen ELISA-Methoden kostet rund das Zwanzigfache. Dieser Nachteil könnte nur durch billigere und schnellere Messmethoden zur Bestimmung der APP-Konzentrationen ausgeglichen werden. Von Nirala und Shtenberg (2019) wurde ein Bioassay zur quantitativen Bestimmung von Hp in Milchproben beschrieben, dessen Ergebnisse mit denen der ELISA-Methode vergleichbar sind. Der Bioassay arbeitet laut den Autoren schnell, billig und kann in ein tragbares Gerät eingebaut werden. Für die Bestimmung der Zellzahl von Viertelgemelksproben im Stall steht der California-Mastitis-Test (CMT) zur Verfügung. Nach einem Beurteilungsschlüssel reagiert das CMT-Reagens erst ab einer Zellzahl von 100.000–250.000 Zellen pro ml Milch mit geringgradiger Schlierenbildung (Winter 2008b). Petzner et al. (2017) validierten Grenzwerte von 150.000 und 200.000 von im Labor bestimmten somatischen Zellen pro ml Gesamtgemelk, um ihre Eignung als Indikatoren für bakteriell hervorgerufene Euterentzündungen zu überprüfen. Der Grenzwert von 150.000 Zellen pro ml Gesamtgemelk eignet sich mit einer Sensitivität von 0,60 und einer Spezifität von 0,49 und der Grenzwert von 200.000 Zellen mit einer Sensitivität von 0,52 und die Spezifität 0,54 für den Nachweis einer durch schwach pathogene Erreger hervorgerufenen Euterentzündung. Der in dieser Arbeit beschriebene Grenzwert einer Hp-Konzentration von 0,21 µg/ml Gesamtgemelk hat eine Sensitivität von 0,76 und eine Spezifität von 0,57 als Indikator, ob eine bakteriell bedingte Euterentzündung vorliegt. Die Bestimmung der Hp-Konzentration könnte demnach in diesem Fall vorteilhaft sein.

In einer umfangreichen Studie von Zoldan et al. (2017) wird über die Identifizierung und Validierung von immunologischen Biomarkern berichtet, die schnell und automatisierbar bestimmbar sind, um Entzündungen des Euters oder anderer Organe in den Milchviehherden rascher nachzuweisen. Wird ein einziger Biomarker verwendet, um eine entzündliche Erkrankung in einer Milchkuh zu erkennen, halten die Autoren Hp für den geeignetsten. Durch die Kombination von Hp mit Lactoferrin oder von Hp mit dem Polymeren Immunglobulin-Rezeptor konnte die Sensitivität und Spezifität noch verbessert werden. Neben der Euterentzündung könnten auch Entzündungsvorgänge in anderen Organen nachgewiesen werden.

Mögliche Anwendungsbereiche der Bestimmung der APP-Konzentration in Milchproben könnten trotzdem vorhanden sein. Schwarz et al. (2011a) fanden in Proben des Vorgemelkes mit ≥ 43.000 Zellen einen hohen Anteil von PMN. Pilla et al. (2012) haben durch Differenzierung und Zählung der Zellen in der Milch herausgefunden, dass bereits ab 1000 Zellen pro ml Milch Entzündungsvorgänge nachweisbar waren. Da Hp von den PMN freigesetzt wird und bei einer fokalen Euterentzündung die Hp-Konzentration um mehr als das 80-Fache ansteigt, könnte die Bestimmung der Hp-Konzentration bei Entzündungsvorgängen mit niedrigen Zellzahlen eine zusätzliche Information zur Verfügung stellen (Whelehan et al. 2011). Zum Nachweis einer Entzündung sind verschiedene Parameter geeignet. Für die Erfassung von Entzündungen gilt, dass damit eine veränderte Reaktionslage der Milchdrüse charakterisiert wird und Trendanalysen ermöglicht werden. Zur Erstellung der Diagnose „Mastitis“ ist jedoch die zusätzliche mikrobiologische Befunderhebung notwendig (Hamann 1999). Gemäß den Leitlinien zur Bekämpfung der Mastitis des Rindes als Bestandsproblem ergibt die Zellzahlbestimmung der Herdensammelmilch nur grobe Anhaltspunkte zur Beurteilung der Eutergesundheit der Herde, da keine ausreichende enge Korrelation zwischen dem Prozentsatz der infizierten Euterviertel in einer Herde und der Herdensammelmilch bestehen. Eine Reihe von Einflüssen wie das Laktationsstadium, die Art des Erregers und Stress auslösende Faktoren beeinflussen den Zellgehalt der Herdensammelmilch (DVG 2012).

Ob die Bestimmung der Konzentration der APPs in der Herdensammelmilch im Vergleich zur Bestimmung der Zellzahl Vorteile bringen könnte, müsste durch weitere entsprechende Studien mit ausreichenden Daten untersucht werden. Sensoren in konventionellen und automatischen Melksystemen, die die Konzentration der APPs während des Melkens messen, wären eine große Hilfestellung, Abweichungen von der Eutergesundheit rasch zu erkennen.

In einer eutergesunden Herde ist die Zellzahl der Herdensammelmilch gleich hoch wie die Zellzahl der Tankmilch, da keine euterkranken Kühe vorhanden sind, deren Milch verworfen wird. Winter (2008b) beschreibt für Zellzahlwerte in der Tankmilch von  125.000 pro ml, dass die Tankmilch von Fleckviehkühen mit sehr guter Eutergesundheit stammt und für Zellzahlwerte von 125.000–250.000 pro ml, dass die Tankmilch von Kühen mit guter Eutergesundheit ermolken wird.
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Ermittlung der Hp-Konzentration und der Vorschlag eines Warnwertes von 0,38 µg/ml in der Herdensammelmilch eine mögliche Ergänzung ist, um Abweichungen der Eutergesundheit in einer Herde zu erkennen.

Es bestehen keine geschützten, finanziellen, beruflichen oder anderen persönlichen Interessen an einem Produkt, Service und/oder einer Firma, welche die in diesem Manuskript dargestellten Inhalte oder Meinungen beeinflussen könnten.

Nicht anwendbar.

Die Kosten für diese Arbeit wurden vom gemeinnützigen Niederösterreichischen Tiergesundheitsdienst übernommen.

JH, MG, EW und PW planten diese Arbeit und führten sie durch. WR erstellte das Manuskript.

Dr. Wigbert Roßmanith
Abt. Veterinärangelegenheiten und Lebensmittelkontrolle
Amt der NÖ Landesregierung
Landhausplatz 1
3109 St. Pölten
Österreich
Wigbert.Rossmanith@noel.gv.at

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