Bakterienvielfalt und Nachweis potenziell pathogener Arten in einer landwirtschaftlichen Biogasanlage – neue Erkenntnisse dank Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung von rRNA-Gen-Amplikons

Bacterial diversity and detection of potentially pathogenic species in an agricultural biogas plant – new insights gained by high-throughput DNA sequencing of rRNA gene amplicons

Berliner und Münchener Tierärztliche Wochenschrift 129, 408-416

DOI: 10.2376/0005-9366-15105

© Schlütersche Verlagsgesellschaft mbH & Co. KG. 2016

Publiziert: 09/2016

Zusammenfassung

Die meisten Umweltbakterien lassen sich nicht im Labor kultivieren, aber sie können direkt, ohne Kultivierung, durch Analysen ihrer 16S rRNA-Gene detektiert und differenziert werden. Dabei werden 16S rRNA-Gene mit ≥ 97 % Sequenzidentität spezifischen OTUs (operational taxonomic units) zugeordnet, was grob dem Arten-Niveau entspricht. Hier wurde kultivierungsunabhängig die Bakterienvielfalt und das mögliche Vorkommen von pathogenen Arten in einer landwirtschaftlichen Biogasanlage untersucht. Die Anlage bestand aus zwei Linien, eine erhielt Silage, die andere Silage plus Rindergülle. Jede Linie bestand aus einem Haupt- und Nachgärer. Insgesamt wurden 3,5 Millionen 16S rRNA-Genabschnitte analysiert. Bioinformatische und phylogenetische Analysen ergaben, dass in jedem Gärer etwa 2150 OTUs, die sich auf insgesamt 53 Klassen verteilten, vorkamen. Clostridia (49–56 % aller Sequenzen), Bacilli (8–12 %) und Bacteroidia (7–10 %) waren besonders stark vertreten. Nur 5,1 % der OTUs reagierten auf den Zusatz von Rindergülle. Eine dominante OTU (6,5–10,9 %) ließ sich dem Komplex Streptococcus bovis/Streptococcus equinus zuordnen. Die 16S rRNA-Gene anderer potenziell pathogener Arten wurde nur in sehr niedriger Abundanz nachgewiesen (≤ 0,01 %), darunter Clostridium tetani, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum oder Mycobacterium tuberculosis. Keine dieser OTUs nahm in ihrer Abundanz in Vergleich von Haupt- zu Nachgärern zu oder wurde durch die Zugabe von Rindergülle signifikant verändert. Ob die identifizierten Sequenzen tatsächlich von pathogenen Bakterien stammen, kann über die 16S rRNA-Gen-Analysen nicht bewiesen werden. Mit der Methode lassen sich jedoch mit sehr hoher Empfindlichkeit potenziell risikoreiche Umweltproben für ggf. weitere diagnostische Verfahren identifizieren.

Summary

Most environmental bacteria cannot be cultivated in the laboratory, but they can be detected and differentiated, independent of cultivation, by analyses of their 16S rRNA genes. DNA-sequences of ≥ 97 identity are grouped together as OTUs (operational taxonomic units), which correspond roughly the species-level. In this study, an agricultural biogas plant was analysed for the diversity of bacterial communities and the potential occurrence of bacterial pathogens during fermentation. The plant consisted of two subsequent fermentation chambers, and two independent lines, both receiving silage, and one, in addition, cattle manure. A total of 3.5 million 16S rRNA gene fragment sequences were analysed. Bioinformatic and phylogenetic analyses indicated that each chamber contained about 2150 OTUs, which could be assigned to 53 different bacterial classes. Clostridia (49–56% of all sequences), Bacilli (8–12%), and Bacteroidia (7–10%) were the most dominant. Only 5.1% of the OTUs responded to the presence of cattle manure. One dominant OTU (6.5–10.9%) belonged to the Streptococcus bovis/Streptococcus equinus complex. The 16S rRNA genes of other potential pathogens occurred only in very low abundances ( lt; 0.01%), including Clostridium tetani, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, or Mycobacterium tuberculosis. None of these OTUs increased between the first and second fermentation chambers. The addition of cattle manure had no significant effect. Clearly 16S rRNA gene sequencing, as applied here, cannot conclusively demonstrate the presence of pathogens, but this approach allows a highly sensitive identification of potentially risky environmental samples which would be relevant for further diagnostic analyses.