Comparison of DNA isolation methods and detection of Salmonella spp. from animal faeces and dust using invA realtime PCR

Berliner und Münchener Tierärztliche Wochenschrift 124, 177-185

DOI: 10.2376/0005-9366-124-177

© Schlütersche Verlagsgesellschaft mbH & Co. KG. 2011

Publiziert: 04/2011

Summary

There is a strong interest to reduce the expenditure for the detection of Salmonella spp. from animal faeces and environmental samples from primary production according to ISO 6519:2002 Annex D by including a rapid and effective method to detect Salmonella spp. already after pre-enrichment in BPW. It has been shown that real-time PCR methods are very effective to detect Salmonella organisms after pre-enrichment of foods. However, materials from primary animal production compose of much higher amounts of substances which might inhibit the sensitivity of real-time PCR. Different techniques of DNA isolation after preenrichment of artificially inoculated bovine faecal material were used to compare their detection limit and detection probability using an invA 5’ nuclease real-time PCR approach. A detection probability of 100% was shown at 105 cfu/ml using the QIAamp® DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Germany), at 104 cfu/ml using the High Pure PCR Template Preparation Kit® (Roche, Germany) and at 103 cfu/ml using thermal cell lysis or an in-house lab protocol, respectively. In comparison DNA isolation by thermal cell lysis revealed a very good detection limit, low costs and almost no risks of contamination. Furthermore, caecal contents from pigs were analysed by ISO 6519:2002 Annex D and the invA real-time PCR using thermal cell lysis for DNA extraction. As a result neither false positive nor false negative findings were obtained. Inclusion of the real-time PCR after pre-enrichment of samples in BPW followed by bacterial detection of Salmonella only with samples positive with real-time PCR might be a valuable tool to fulfil the international standard of ISO 6519:2002 Annex D but also to diminish the expenditures. However, it must be stated that the modification of an international standard method and its use in routine diagnostic requires the validation and registration of national and/ or international competent authorities.

Zusammenfassung

Es gibt ein starkes Interesse, den Material- und Zeitaufwand für den Nachweis von Salmonella spp. aus Tierkot und Umgebungsproben entsprechend der ISO Norm 6519:2002 Anhang D durch die Einbeziehung einer schnellen und effektiven Methode zum Nachweis von Salmonellen direkt nach der Voranreicherung zu verringern. Es wurde gezeigt, dass die real-time-PCR eine sehr effektive Methode für den Nachweis von Salmonellen aus Lebensmitteln nach einer Voranreicherung ist. Im Gegensatz dazu sind in Proben aus dem Tierbereich jedoch viel größere Mengen an bakterieller Sekundärflora und an hemmenden Substanzen vorhanden, die die Sensitivität der real-time-PCR beeinträchtigen können. Daher wurden verschiedene Methoden zur Isolation von DNA nach einer Voranreicherung von Salmonellen mit Tierkot verglichen, um das Detektionslimit und die Detektionswahrscheinlichkeit mithilfe einer invA-basierten real-time-PCR zu bestimmen. Eine Detektionswahrscheinlichkeit von 100 % konnte mit dem QIAamp® DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Deutschland) erst ab 105 kbE/ml, mit dem High Pure PCR Template Preparation Kit® (Roche, Deutschland) ab 104 kbE/ml und sowohl bei der Kochlyse als auch bei einem neu entwickelten Hausprotokoll ab 103 kbE/ml erreicht werden. Im Vergleich aller verwendeten DNA-Extraktionsmethoden besitzt die Kochlyse eine sehr gute Nachweisgrenze, ein geringes Kontaminationsrisiko und verursacht sehr geringe Kosten. Darüber hinaus wurden Proben aus dem Zäkum-Inhalt von Mastschweinen nach ISO 6519:2002 Annex D und der invA-basierten real-time-PCR mit Kochlyse zur DNA-Isolation untersucht. Der Vergleich zeigte, dass weder falsch positive noch falsch negative Ergebnisse auftraten. Die Einbeziehung der invA-real-time-PCR nach einer Voranreicherung der Proben und die nachfolgende Fortsetzung des Nachweises von Salmonellen nur mit den Proben, die mittels real-time-PCR positiv waren, könnte ein Verfahren darstellen, um sowohl die Anforderungen der ISO 6519:2002 Anhang D zu erfüllen aber gleichermaßen den Aufwand für diese Methode zu verringen. Es muss jedoch darauf hingewiesen werden, dass die Modifikation einer international gültigen Standardmethode und deren Anwendung in der Routinediagnostik eine entsprechende Validierung und Zulassung durch die zuständigen nationalen und internationalen Behörden erfordert.