Nachweis und Quantifizierung von PCV-3 in österreichischen Schweinen mittels duplex Real-Time PCR

Im Jahr 2015 wurde ein bislang unbekanntes Circovirus, PCV-3, von zwei unabhängigen Forscherteams in den USA entdeckt. In beiden Fällen zeigten die Tiere klinische Symptome wie PDNS und kardiovaskuläre Entzündungen (Palinski et al. 2016, Phan et al. 2016). Seitdem wurde PCV-3 in diversen europäischen, asiatischen und amerikanischen Ländern, wie Deutschland, Spanien, Ungarn, Polen, China, Korea, USA und Brasilien detektiert. Auch in diesen Studien zeigten die Tiere Symptome wie gastrointestinale, neurologische, respiratorische, reproduktive und systemische Probleme (Palinski et al. 2016, Stadejek et al. 2017, Fux et al. 2018, Kim et al. 2018a, Klaumann et al. 2018a, Shen et al. 2018, Tochetto et al. 2018, Deim et al. 2019).

In anderen Studien wurde PCV-3 jedoch auch in klinisch unauffälligen Schweinen nachgewiesen (Zheng et al. 2017, Zou et al. 2018, Saporiti et al. 2020). Studien zur Pathogenität von PCV-3 sind auch durch die Tatsache eingeschränkt, dass das Virus bisher nicht in Reinkultur isoliert werden konnte und entsprechende Infektionsversuche daher nicht möglich sind (Klaumann et al. 2018b). Das trifft ebenso auf das jüngst entdeckte PCV-4 zu, dessen Vorkommen bisher nur in Asien beschrieben wurde (Wang et al. 2022).

Trotz der bisher erfolgten Nachweise von PCV-3 in unmittelbaren Nachbarländern und der Hinweise zur Pathogenität dieses Virus gibt es bisher nur vereinzelt Erkenntnisse zum Vorkommen dieses Virus in Österreich (Eddicks et al. 2022).

Das erste Ziel dieser Arbeit war es, eine geeignete Real-Time PCR-Methode zur Detektion von PCV-3 zu validieren und anschließend Serum und Organproben von Hausschweinen aus Österreich auf PCV-3 zu testen.

Nach sorgfältiger Analyse der veröffentlichten PCR-Methoden erschien als Grundlage die von Palinski et al. (2016) publizierte PCV-3 Real-Time PCR am vielversprechendsten. Diese wurde zu einer duplex Real-Time PCR-Methode zur parallelen Detektion von PCV-3 und β-Aktin als endogene Kontrolle weiterentwickelt. Anschließend wurden die Seren und Organe von gesunden Ebern und kranken bzw. mit anderen Erregern infizierten Schweinen auf das Vorhandensein von PCV-3-DNA getestet und deren Viruslast mittels absoluter Quantifizierung erhoben.

Für den Nachweis des zellulären β-Aktin Gens wurden die Primer β-Aktin-1030-F (5‘-AGC GCA AGT ACT CCG TGT G-3‘), β-Aktin-1135-R (5‘-CGG ACT CAT CGT ACT CCT GCT T-3‘) und die Sonde β-Aktin-1081-HEX (5‘-HEX-TCG CTG TCC ACC TTC CAG CAG ATG T-BHQ1-3‘) ausgewählt (Toussaint et al. 2007).

Um den Einfluss von Schweine-Nukleinsäure auf die PCV-3 Detektion alleine und in Kombination mit einer parallelen β-Aktin-Detektion zu untersuchen (PCV-3/β-Aktin duplex Real-Time PCR), wurde im nächsten Schritt eine Verdünnungsreihe der PCV-3 Positivkontrolle (108 bis 10–2 Kopien/µl) in gepoolten Nukleinsäureextrakten von Schweineorganen hergestellt, welche zuvor negativ auf PCV-3 getestet worden waren. Diese Verdünnungsreihe wurde unter drei unterschiedlichen Bedingungen angesetzt: einmal ohne parallele β-Aktin-Detektion und zweimal mit β-Aktin-Detektion (0,2 µM pro Primer, bzw. 0,1 µM Sonde), wobei eine PCV-3 Primerkonzentration von 0,8 µM mit einer PCV-3 Primerkonzentration von 0,4 µM je Primer verglichen wurde. Die Konzentration der PCV-3-Sonde betrug jeweils 0,2 µM. Diese drei unterschiedlichen Ansätze wurden im Duplikat in einem einzigen Lauf getestet.

Das PCR-Protokoll beinhaltete folgende Schritte: 15 Minuten initiale Denaturierung bei 95 °C, 15 Sekunden Denaturierung bei 95 °C und Annealing/Extension für 60 Sekunden bei 60 °C für 45 Zyklen.

Die Spezifität der PCV-3/β-Aktin duplex Real-Time PCR wurde mithilfe folgender Viren und Bakterien getestet, die entweder der Familie Circoviridae angehören, oder als Krankheitserreger in Schweinen vorkommen: PCV-1, PCV-2, Psittacines Beak and Feather Disease Virus, Porzines Reproduktives und Respiratorisches Syndrom Virus 1 und 2 (PRRSV), Afrikanisches Schweinepest Virus (ASFV), Klassisches Schweinepest Virus (CSFV), Suides Herpesvirus 1 (SuHV-1), Porzines Parvovirus (PPV), Schweineinfluenzavirus (SIV), Leptospira sp., Chlamydia abortus, Coxiella burnetii, Brucella suis, Rotavirus, Porzines Enterovirus, Porzines Teschovirus, Salmonella enteritidis, Porzines Deltacoronavirus, Clostridium perfringens Typ A, Lawsonia intracellularis, Escherichia coli, Transmissibles Gastroenteritis Virus, Porzines Epidemisches Diarrhoe Virus, Brachyspira hyodysenteriae/intermedia /innocens /murdochii /pilosicoli.

Zur Spezifitätstestung wurden Extrakte von Schweineseren und Organpools herangezogen, welche zuvor mittels PCR positiv auf den jeweiligen Erreger getestet worden waren. Für die Detektion der Leptospira sp. wurde das Extrakt einer Bakterienkultur verwendet. Die Proben wurden im Einfachansatz getestet.

27 Schweineseren stammten von klinisch gesunden Ebern mehrerer Betriebe, die im Rahmen periodisch stattfindender Gesundheitskontrollen mittels PCR auf PRRSV getestet worden waren, wobei alle Proben negativ waren. Die anderen 30 Seren von neun Ferkeln, drei Jungsauen, zwei Mastschweinen, fünf Zuchtsauen und elf Proben von Schweinen unbekannten Alters stammten aus mindestens 15 verschiedenen Betrieben. Sie waren alle mittels PCR positiv auf PRRSV und/oder PCV-2 getestet worden und zeigten laut Vorbericht zumeist Symptomatik wie Husten, Fieber, Kümmern oder Aborte.

119 der 160 getesteten Organpools stammten von klinisch kranken Schweinen aus mindestens 62 verschiedenen Betrieben, die im Rahmen eines amtlichen Monitorings mittels PCR auf ASFV und CSFV getestet worden waren. Die Organpools enthielten vor allem Proben von Milz, Niere, Leber, Lunge, Lymphknoten und Tonsillen, fallweise auch von Darm und Herz. Die Tiere zeigten, soweit bekannt, vor allem Symptome wie Kümmern, Durchfall und Atemwegsproblematik wie Husten, aber auch Arthritis oder ZNS-Symptome. Es wurden 77 Ferkel, 21 Mastschweine, eine Zuchtsau und 20 Schweine unbekannten Alters getestet.

Die restlichen Organpools (zumeist aus Lunge, Milz und Plazenta) wurden von 41 Aborten entnommen, die aus 39 Betrieben stammten und im Rahmen eines weiteren amtlichen Screenings mittels PCR auf vier anzeigepflichtige Schweineerreger (Brucella sp., ASFV, CSFV und SuHV-1) getestet worden waren. Einige dieser Aborte wurden auf Verlangen der Einsender zusätzlich mittels PCR auf PCV-2, PRRSV, Chlamydia abortus, PPV, Leptospira sp., SIV und Pestiviren getestet.

Die Nukleinsäureextraktion aller Proben erfolgte automatisch auf dem Kingfisher^® Flex (^®Thermo Fisher Scientific). Zur Organextraktion wurde der NukleoMag^® VET (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland), zur Extraktion von Flüssigkeiten der MagVet^® Universal Isolation Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) verwendet. Die extrahierte Nukleinsäure wurde bei einer Ausgangsmenge von 100 µl Serum bzw. 200 µl Organhomogenat in einem Volumen von 80 µl (Serum) bzw. 100 µl (Organhomogenat) eluiert. Die Extrakte wurden zur Kurzzeitlagerung bei -25 °C, zur Langzeitlagerung bei -70 °C gelagert. Als negative Extraktionskontrolle wurde nukleasefreies Wasser verwendet.

Für die anschließende PCR wurde als Negativkontrolle nukleasefreies Wasser, als Positivkontrolle eine Verdünnungsstufe der Positivkontrolle mit einer Konzentration von 10³ Kopien/µl verwendet.

Alle PCV-3-positiven Proben wurden anschließend in einem separaten Real-Time PCR-Lauf quantifiziert. Dazu wurden eine Verdünnungsreihe von 108 bis 10–2 Kopien/µl und die positiven Proben im Doppelansatz gemessen. Nur Proben, bei denen sich das positive PCR-Ergebnis im ersten Lauf in zumindest einem Replikat des Quantifizierungslaufes bestätigen ließ, wurden final als PCV-3 positiv beurteilt.

Zur Bestimmung der Kopienzahl/ml Ausgangsprobe wurde die experimentell erhobene Kopienzahl pro PCR mit dem Faktor 320 (Serum) bzw. 200 (Organhomogenate) multipliziert. Dieser Faktor ergab sich aus dem oben beschriebenen Verhältnis von Proben- und Eluatmenge bei der Extraktion und einem Einsatz von 2,5 µl Eluat in der PCV-3/β-Aktin duplex Real-Time PCR. Als Quantifizierungslimit wurden 250 Kopien/PCR festgelegt (siehe Ergebnisse).

Der dafür notwendige Standard, der eine Konzentration von 106 Kopien/PCR aufwies, wurde ebenfalls von der Firma bereitgestellt und in tRNA verdünnt. Im Anschluss wurden alle PCV-3-positiven Proben sowie vier PCV-3-negative Proben mit dem Kit getestet und mittels einer Verdünnungsreihe von 106 bis 101 Kopien/PCR quantifiziert. Alle Proben wurden im Doppelansatz getestet. Positivkontrolle und exogene Kontrolle sind Bestandteils des Testkits. Als Negativkontrolle wurde steriles Wasser verwendet. Reaktionsansatz sowie Temperaturprofil wurden dem Handbuch entsprechend übernommen.

Der Faktor zur Berechnung der Kopienzahl/ml Probe beim Biosellal-Kit betrug für Organe 100 und für Seren 160, da pro Reaktionsansatz 5 µl Eluat verwendet wurde.

Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte mit der 7500 Software v2.3 bzw. der Bio-Rad CFX Maestro-Software. Beim 7500 Fast-Cycler wurde das Fluoreszenzsignal des Reporters gegen 6-Carboxyl-X-Rhodamine (ROX^®) normalisiert. Zur Cq-Wert-Bestimmung wurde bei beiden Cyclern die Fit-Point Methode angewendet.

Statistische Kennzahlen wurden sowohl automatisch mithilfe der 7500 Software v2.3 bzw. der Bio-Rad CFX Maestro-Software als auch manuell mithilfe von Excel 2007 und Excel 2016 berechnet.

In der Gradienten-PCR konnten alle Verdünnungsstufen von 108 bis 101 Kopien/µl bei jeder Annealing-/Extensionstemperatur detektiert werden. Die Nachweisgrenze wurde somit durch keine der unterschiedlichen Temperaturen verschlechtert. Da bei einer Annealing-/Extensionstemperatur von 60 °C das stärkste Fluoreszenzsignal detektiert wurde und der Cq-Wert im mittleren Bereich lag, wurde diese Temperatur für alle weiteren Analysen beibehalten.

Die Auswertung der Primer-Matrix zeigte nur geringe Unterschiede zwischen den durchschnittlichen Cq-Werten, die mit den getesteten Primerkonzentrationen erzielt wurden: diese schwankten zwischen 26,3 und 26,6 (maximale Differenz von 0,3 Zyklen). Die unterschiedlichen Konzentrationen hatten daher kaum Einfluss auf die Amplifikation der PCR. Jedoch wurden bei einer Endkonzentration von 0,2 µM bei Forward- und/oder Reverse-Primer die höchsten Cq-Werte und die schwächsten Fluoreszenzsignale detektiert. Bei den Konzentrationen 0,4, 0,6 und 0,8 µM war keine derartige Tendenz zu erkennen.

Der Vergleich zwischen den beiden PCV-3 Primerkonzentrationen von 0,4 und 0,8 µM (mit paralleler β-Aktin-Detektion) zeigte, dass bei den einzelnen Verdünnungen von 108 bis 102 Kopien/µl kaum Unterschiede zwischen den Cq-Werten und der Stärke des Fluoreszenzsignals vorhanden waren. Die Differenz der durchschnittlichen Cq-Werte lag unter einem Zyklus. Erst bei einer Templatekonzentration von 101 Kopien/µl wurde eine starke Differenz (2,5 Zyklen) der durchschnittlichen Cq-Werte zwischen den getesteten Primer-Konzentrationen beobachtet, wobei bei einer Primerkonzentration von 0,4 µM die Cq-Werte niedriger und das Fluoreszenzsignal stärker waren als bei 0,8 µM. Daher wurde für die PCV-3/β-Aktin duplex Real-Time PCR eine PCV-3 Primerkonzentration von 0,4 µM festgelegt. Da bei einer PCV-3 Konzentration von 101 Kopien/µl die Replikate bereits eine Standardabweichung von über 0,5 Cq aufwiesen und die Linearität der Standardkurve nicht länger gegeben war, wurde das Quantifizierungslimit für die duplex Real-Time PCR auf 10² Kopien/µl (250 Kopien/PCR) festgelegt.

Keiner der im Kapitel „Material und Methoden“ angeführten nicht PCV-3 Erreger wurde im Rahmen des Spezifitätstests von der PCV-3/β-Aktin duplex Real-Time PCR detektiert.

Zwei der 30 Seren (6,7 %) von kranken Schweinen waren PCV-3-positiv. Beide waren mittels PCR zuvor positiv auf PRRSV und eine der beiden zusätzlich positiv auf PCV-2 getestet worden. Die Cq-Werte der PCV-3-PCR betrugen 37,6 und 38,4. Eine der beiden positiven Proben stammte von einem Ferkel, die zweite von einem Schwein unbekannten Alters.

15 der 119 Organpools (12,6 %) wurden positiv auf PCV-3 getestet, wobei die Cq-Werte zwischen 22,1 und 44,7 lagen. Dabei waren von 77 Ferkeln zehn PCV-3-positiv (13,0 %), von 21 Mastschweinen waren drei positiv (14,3 %). Zwei positive Proben stammten von Schweinen unbekannten Alters. Von den PCV-3 positiven Tieren litten zwei an Anämie nach dem Absetzen, fünf hatten Durchfall und/oder kümmerten, ein Tier hatte Fieber und Husten, ein weiteres hatte Arthritis. Die Symptomatik der restlichen sechs Tiere war unbekannt.

Vier der 41 Organpools (9,8 %) von Aborten wurden PCV-3-positiv getestet. Die Cq-Werte reichten von 19,2 bis 38,5. Nur zwei der PCV-3-positiven Aborte waren mit einem anderen Krankheitserreger (PCV-2 bzw. PRRSV) koinfiziert.

In Summe wurden sechs von 56 Seren (10,7 %) und 19 von 160 Organpools bzw. Aborten (11,9 %) positiv auf PCV-3 getestet.

Das Quantifizierungslimit des kommerziellen Kits lag bei 10 Kopien/PCR und war damit geringer als das der PCV-3/β-Aktin duplex Real-Time PCR (250 Kopien/PCR). Daher konnten mit dem kommerziellen Kit vier weitere Proben, darunter zwei Seren, quantifiziert werden. Die ermittelte Kopienzahl/ml Probe war bei der PCV-3/β-Aktin duplex Real-Time PCR allerdings deutlich höher (durchschnittlich um einen Faktor von 9,17) als beim kommerziellen Kit (Tab. 2).

In dieser Arbeit wurde eine PCV-3-β-Aktin duplex Real-Time PCR zur parallelen Detektion von PCV-3 und β-Aktin als endogene Kontrolle etabliert. Die parallele β-Aktin-Detektion führte zu einer geringen Verschlechterung der PCR-Performance, vor allem der PCR-Effizienz (Daten nicht gezeigt). Jedoch wird dieser Nachteil durch die Tatsache aufgehoben, dass die endogene Kontrolle eine wichtige Rolle bei der Vermeidung falsch negativer Testergebnisse spielt und die Materialkosten durch das duplex Real-Time PCR-Verfahren kaum erhöht wurden.

Unseres Wissens hatte bisher nur eine einzige Studie Proben von österreichischen Schweinen auf PCV-3 untersucht: Eddicks et al. (2022) fanden bei von ihren Müttern erdrückten Saugferkeln aus insgesamt 16 deutschen und österreichischen Betrieben eine individuelle PCV-3 Positivität von 13%, wobei die österreichischen Betriebe nicht gesondert ausgewiesen wurden. In der hier vorgestellten Untersuchung ausschließlich österreichischer Proben wurden vier von 26 Seren (15,4 %) gesunder Eber, zwei von 30 Seren (6,7 %) PCV-2 bzw. PRRSV infizierter Schweine, 15 von 119 Organpools (12,6 %) von klinisch auffälligen Schweinen und vier von 41 Organpools (9,8 %) von Aborten positiv auf PCV-3 getestet. Es ist jedoch wichtig darauf hinzuweisen, dass im Rahmen dieser Studie keine repräsentative Stichprobe untersucht wurde und die hier berichteten Häufigkeiten somit kaum ein realitätsnahes Abbild der tatsächlichen PCV-3 Prävalenz in Österreich darstellen. Dennoch sind die in unserem Probenmaterial gefundenen Häufigkeiten durchaus vergleichbar mit den Studien von Hayashi et al. (2018) mit 9,6 %, Klaumann et al. (2018a) mit 11,5 % sowie Kim et al. (2018a) mit 12,9 % PCV-3-positiven Proben. In den Untersuchungen von Wen et al. (2018) und Zheng et al. (2017) hingegen wurden wesentlich höhere PCV-3-Prävalenzen ermittelt (38,0 % sowie 59,5 %).

PCV-3 wurde in mehreren Studien bei Schweinen mit respiratorischen, gastrointestinalen, systemischen oder reproduktiven Symptomen detektiert (Zhai et al. 2017, Zheng et al. 2017, Klaumann et al. 2018a). Auch in dieser Arbeit konnte PCV-3 in kranken, aber auch in klinisch gesunden Schweinen nachgewiesen werden. Der Nachweis von PCV-3 im Serum klinisch unauffälliger Schweine wurde ebenfalls von mehreren Autoren beschrieben (Zheng et al. 2017, Saporiti et al. 2020).

Die Viruslast der PCV-3-positiven Proben in der hier vorgestellten Untersuchung war zumeist niedrig. Daher waren nur elf der 25 positiven Proben (44 %), bei denen es sich sämtlich um Organpools handelte, mit der PCV-3/β-Aktin duplex Real-Time PCR seriös quantifizierbar. Diese stammten von klinisch auffälligen Schweinen mit reproduktiven Beschwerden, gastrointestinalen Problemen, Anämie, Arthritis oder unbekannten Symptomen. Für PCV-2 wird angenommen, dass der Schweregrad von PDNS und PMWS mit der Viruslast korreliert (Olvera et al. 2004). Dies könnte bei PCV-3 auch der Fall sein, wie Fux et al. (2018) und Zhai et al. (2017) bereits andeuteten. Würde in Analogie zu PCV-2 für PCV-3 ebenfalls ein Grenzwert zur klinischen Signifikanz von 107 Kopien/ml Serum angenommen (Olvera et al. 2004), so wäre dies bei sechs der in dieser Studie untersuchten Schweine der Fall. Derzeit gibt es jedoch noch keinen Konsens hinsichtlich der Aussagekraft einer hohen bzw. niedrigen PCV-3-Viruslast oder davon ableitbare diagnostisch verwendbare Grenzwerte zur Differenzierung einer klinisch manifesten Erkrankung von einer subklinischen Infektion.

Keines der PCV-3-positiven Seren, sowohl von erkrankten als auch von gesunden Schweinen, konnte aufgrund der niedrigen Viruslasten von unter 250 Kopien/PCR, mit der PCV-3-β-Aktin duplex Real-Time PCR quantifiziert werden. Eine mögliche Erklärung dafür könnte eine generell niedrigere Viruslast in Seren sein. Auch Fux et al. (2018) und Saporiti et al. (2020) wiesen in ihren Studien auf die niedrige Viruslast in Seren hin. Dabei unterschied sich die Viruslast klinisch gesunder nicht von der kranker Schweine (Saporiti et al. 2020), ein klarer Kontrast zu PCV-2 (Olvera et al. 2004).

PCV-3 wurde von Palinski et al. (2016) erstmals in Aborten auf einer Farm in den USA detektiert. Tochetto et al. (2018) wiesen PCV-3 in Schweinen nach, die zuvor Totgeburten zur Welt gebracht hatten. Auch in dieser Arbeit konnte PCV-3 in Aborten nachgewiesen werden. Während die Viruslast bei drei getesteten Aborten unterhalb des Quantifizierungslimits blieb, wurde bei einem Abort mit 9,10 x 108 Kopien/ml die höchste in dieser Studie gemessene Viruslast gemessen. Zudem wurden in dieser Probe mehrere relevante virale und bakterielle Schweineerreger (ASFV, CSFV, SuHV-1, Brucella suis, PCV-2, PRRSV, Chlamydia abortus, PPV, Leptospira sp.) ausgeschlossen.

Eine oft wenig berücksichtigte Quelle von Variabilität bei der Erhebung von quantitativen PCR Daten kann auch die Auswahl der PCR-Methodik mit sich bringen: ein Vergleich zwischen der PCV-3/β-Aktin duplex Real-Time PCR mit einem kommerziellen Kit anhand von insgesamt 25 PCV-3-positiven und vier negativen Proben zeigte qualitativ 100 % übereinstimmende Ergebnisse. Der kommerzielle Kit hatte ein niedrigeres Quantifizierungslimit (10 Kopien/PCR) als die PCV-3-β-Aktin duplex Real-Time PCR (250 Kopien/PCR). Allerdings war die experimentell bestimmte Kopienzahl/ml Probe bei der PCV-3-β-Aktin duplex Real-Time PCR durchschnittlich etwa zehnfach höher als beim kommerziellen Kit. Mögliche Gründe dafür könnten sein, dass die Zielregionen der beiden verglichenen Tests in unterschiedlichen PCV-3 Genregionen liegen, da die PCV-3/β-Aktin duplex Real-Time PCR gegen das Cap-Gen, der kommerzielle Kit hingegen gegen das Rep-Gen gerichtet ist. Auch Unterschiede in der Art und Präparation der verwendeten Standards (synthetisierte einzelsträngige DNA versus doppelsträngiger Plasmidstandard) oder Mismatches zwischen Primer bzw. Sonde und der Zielregion in den Proben könnten eine Erklärung für diese Differenz liefern (Klein et al. 2001). Aufgrund der proprietären Natur der Sequenzen von Plasmidstandard, Primern und Sonden beim kommerziellen Testkit kann die Hypothese, dass Mismatches für die mit diesem Kit gemessenen geringeren PCV-3 Viruslasten verantwortlich sind, nicht überprüft werden.

Die in dieser Studie beobachtete Diskrepanz in der absoluten Quantifizierung der PCV-3 Kopienanzahl in den parallel untersuchten Proben (im Mittel etwa eine log10-Stufe) mag überraschend hoch erscheinen. Generell ist jedoch eine hohe Variabilität zwischen Real-Time PCR-Assays bzw. durchführenden Laboratorien keine Seltenheit: für PCV-2 wurden im Rahmen einer Vergleichsuntersuchung derselben Proben mit zwei unterschiedlichen Real-Time PCR Assays ein systemischer Unterschied in der Viruslast von 1,4 log10 Stufen berichtet (Hjulsager et al. 2009). Eine weitere ähnlich angelegte Studie, die bis zu sieben PCV-2 Real-Time PCR - Assays verglich, kam auf Unterschiede von bis zu 4 log10 Stufen bei der quantitativen Analyse ein- und derselben Probe (Harding et al. 2009). Beide Autoren weisen folgerichtig auch darauf hin, dass es wenig zielführend ist, quantitative PCV-2 Werte zwischen Laboren oder Methoden zu vergleichen. Für PCV-3 ist außer dem hier vorgestellten nur ein weiterer Vergleichsversuch bekannt: in diesem wurde die Quantifizierung eines Plasmidstandards durch eine Real-Time PCR mit der durch eine digitale PCR (digital droplet PCR; ddPCR), die dieselben Primer und Sonden verwendet, publiziert (Liu et al. 2019). Dabei wurden in der Real-Time PCR sowohl für ein PCV-2 als auch ein PCV-3 Plasmid etwa 10-fach höhere Werte gemessen, als in der ddPCR. In der ddPCR entfällt die Notwendigkeit eines externen Standards und dadurch bedingter Fehlerquellen, jedoch ist die Real-Time PCR für die klinische Anwendung (z.B. Quantifizierung der Viruslast) besser geeignet, da ihr Detektionsbereich wesentlich breiter ist (Liu et al. 2019). Eine Anregung für die bessere Standardisierbarkeit jeglicher quantitativen PCV-2 oder PCV-3 Bestimmung könnte daher die Kalibrierung von Real-Time PCR Verfahren anhand von ddPCR sein. Des Weiteren sollten Labore durch regelmäßige Teilnahme an quantitativen Laborvergleichsuntersuchungen gegenüber ihrer Kundschaft den Nachweis einer guten Quantifizierungspraxis belegen können.

Die PCV-3/β-Aktin duplex Real-Time PCR hat neben dem günstigeren Preis im Vergleich zum kommerziellen Assay den Vorteil, dass hier eine endogene Kontrolle (β-Aktin) verwendet wird, wodurch die Probenqualität besser beurteilt werden kann. Ein Vorteil des kommerziellen Kits liegt in der differenzialdiagnostischen Detektion von PCV-3 und PCV-2. Dies ist insofern interessant, da diese beiden Erreger im Zusammenhang mit ähnlicher klinischer Symptomatik beschrieben wurden (Palinski et al. 2016, Phan et al. 2016). Eine Einbindung eines PCV-2 Assays in die PCV-3-β-Aktin duplex Real-Time PCR wäre daher hinsichtlich diagnostischer Aussagekraft und weiterer Kostensenkung vorteilhaft (Li et al. 2018).

In dieser Arbeit wurde eine duplex Real-Time PCR Methode zur parallelen Detektion von PCV-3 und β-Aktin in Serum und Organpools etabliert und damit PCV-3-DNA in österreichischen Schweinen nachgewiesen und quantifiziert. PCV-3 konnte sowohl in Proben klinisch gesunder, als auch erkrankter oder mit anderen Erregern koinfizierter Schweine gefunden werden, wobei hohe Viruslasten ausschließlich in Gewebeproben sowie in Abortmaterial nachweisbar waren. Die vorliegende Studie bestätigt, dass PCV-3 in Österreich sowohl in erkrankten als auch klinisch unauffälligen Schweinen zu einem gewissen Prozentsatz verbreitet ist.

Die Autoren versichern, dass keine geschützten, beruflichen oder anderweitigen persönlichen Interessen an einem Produkt oder einer Firma bestehen, welche die in dieser Veröffentlichung genannten Inhalte oder Meinungen beeinflussen können.