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Dr. Maria Christian an ihrem Arbeitsplatz. Vor allem wenn Proben von mehreren Tieren bearbeitet werden, ist nicht nur die genau zuordenbare 
Beschriftung der Objektträger/des Materials wichtig, sondern auch das Führen eines Laborbuchs mit Notizen zu jedem Patienten.
Foto: Privat
Dr. Maria Christian an ihrem Arbeitsplatz. Vor allem wenn Proben von mehreren Tieren bearbeitet werden, ist nicht nur die genau zuordenbare Beschriftung der Objektträger/des Materials wichtig, sondern auch das Führen eines Laborbuchs mit Notizen zu jedem Patienten.

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Erfolgreiche Labordiagnostik in der Dermatologie

Wichtig bei der mikroskopischen und kulturellen Untersuchung von Hautmaterial dermatologischer Patienten im Labor der Ordination sind die Wahl des richtigen Probenmaterials, Entnahmetechnik und Aufbereitung.

Von Maria Christian und Regina Wagner

Die Haut als größtes Organ des Körpers ist für diagnostische Untersuchungen leicht zugänglich, dennoch ist die Auf­arbeitung von dermatologischen Patienten oft schwierig. Daher ist es ratsam, Hautpatienten immer nach einem festgelegten diagnostischen Plan zu untersuchen. Einer ausführlichen Anamnese  – am besten anhand eines Anamnesebogens, der schon im Vorfeld (z. B. im Warteraum) ausgefüllt wird – und einer klinisch-dermatologischen Untersuchung folgt die eingehendere Begutachtung der Veränderungen, die im dermatologischen Untersuchungsgang festgestellt wurden. Am Beginn der Labordiagnostik steht die mikroskopische Untersuchung von Material der Hautoberfläche bzw. von Haaren. So können Bakterien, Pilze, Hefen oder Parasiten sowie Entzündungszellen schnell identifiziert werden. Auch für die kulturelle Untersuchung zum Nachweis von Dermatophyten stehen Testkits zur Anwendung in der tierärztlichen Praxis zur Verfügung.

Die Aussagekraft der möglichen Untersuchungen hängt allerdings stark von der Auswahl des richtigen Probenmaterials, der Art der Probenentnahme und der Aufbereitung des gewonnenen Materials ab (. Tab. 1).

Klebestreifenabklatsch

Die beste Methode zum Nachweis von Cheyletiellen (Abb. 1) ist die Klebestreifen-Methode (siehe auch Seite 33). Diese Milben können Juckreiz und vermehrte Schuppenbildung v. a. am Rücken verursachen. Durch das mehrmalige Andrücken des Klebestreifens auf betroffene Hautstellen wird das Probenmaterial gewonnen. Alternativ können Schuppen zuerst mit einem Kamm gesammelt werden bzw. kann bei massiver Schuppung das Material auch direkt vom Untersuchungstisch aufgenommen werden. Anschließend wird ein Tropfen Paraffinöl auf einen Objektträger aufgebracht und der Klebe­streifen darüber geklebt. Das Öl verbessert die Beurteilbarkeit des Materials unter dem Mikroskop. Das Präparat wird mit dem 4x-Objektiv bei weg­geklapptem/gesenktem Kondensor komplett durchgemustert, da meistens nur wenige Milben oder deren Eier vorhanden sind.

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Abb. 1: Pelzmilbe (Cheyletiella spp.); Cheyletiellen leben auf der Hautoberfläche und ernähren sich von Gewebsflüssigkeiten. Der gesamte Entwicklungszyklus findet am Wirt statt, daher können auch die Eier der Milben an den Haaren gefunden werden.
Foto: Laboklin
Abb. 1: Pelzmilbe (Cheyletiella spp.); Cheyletiellen leben auf der Hautoberfläche und ernähren sich von Gewebsflüssigkeiten. Der gesamte Entwicklungszyklus findet am Wirt statt, daher können auch die Eier der Milben an den Haaren gefunden werden.

Oberflächliches Hautgeschabsel

Zum Nachweis von Sarcoptesmilben und den seltener auftretenden Notoedresmilben bei Katzen wird ein oberflächliches Hautgeschabsel angefertigt. Mit einer gebrauchten/stumpfen Skalpellklinge (zur Minimierung der Verletzungsgefahr), die in Paraffinöl getaucht wird (damit das abgeschabte Material haften bleibt), wird an den zuvor geschorenen Haut­arealen oberflächlich abgeschabt. Da Sarcoptesmilben meist nur in geringer Zahl vorliegen, wird das Probenmaterial idealerweise an mehreren Stellen (besonders an den Ohrrändern und am Ellbogen) sowie großflächig gewonnen. Außerdem erhöht die Beprobung von frischen Papeln die diagnostische Treffsicherheit.

Die gewonnene Probe wird mit einem weiteren Tropfen Paraffinöl auf einem Objektträger verteilt, mit einem Deckgläschen versehen und im Mikroskop vollständig durchgemustert (4x- oder 10x-Objektiv mit weggeklapptem oder gesenktem Kondensor).

Zur Diagnose einer Sarcoptesräude stehen außerdem eine PCR aus einem Hautgeschabsel (ohne Paraffinöl) bzw. eine Antikörper-Titer-­Bestimmung aus dem Serum zur Verfügung.

„Ein Hund ist wie ein Herz auf vier Beinen“

Das irische Sprichwort spricht Tierärztin Dr. Regina Wagner, die im Waldviertel Französische Wasserhunde züchtet, aus der Seele.
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Tiefes Hautgeschabsel

Demodexmilben (Abb. 2) leben tief in den Haarfollikeln, daher dient das tiefe Hautgeschabsel der Diagnose der Demodikose. Mit einer (stumpfen) Skalpellklinge oder auch einem scharfen Löffel und Paraffinöl (. s. oberflächliches Geschabsel) zur Befeuchtung wird so lange in Haarwuchsrichtung über die Haut geschabt, bis eine kapilläre Blutung entsteht. Zwischen den Schabungen sollte die Haut immer wieder gequetscht werden, um die Milben aus der Tiefe der Haarfollikel an die Oberfläche zu befördern. Beprobt werden am besten jene Stellen, die Effloreszenzen wie Rötung, Alopezie, Schuppung oder Komedonen (Mitesser) bzw. Keratinmanschetten zeigen.

Das abgeschabte Material wird sogleich auf einen Objektträger gestrichen und gut mit dem Öl vermengt, weil das Probenmaterial durch die Blutung zu Klumpen gerinnen kann und somit schlechter beurteilbar wird. Mit einem Deckgläschen versehen wird das Material mit dem 4x- oder 10x-Objektiv untersucht. Demodexmilben sind teilweise in großer Anzahl vorhanden und oft auch am Präparat – sofern epilierte Haare dabei sind – noch entlang der Haarwurzeln zu finden.

Neben dem mikroskopischen Nachweis gibt es zur Diagnose der Demodikose auch eine PCR, die alle bei Hund (D. canis, D. injai, D. cornei) und Katze (D. cati, D. gatoi, D. felis) beschriebenen Arten erfasst.

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Abb. 2: Haarbalgmilben (Demodex canis) und deren Eier (Pfeil); Demodexmilben leben in den Haarfollikeln und ernähren sich von Talg und 
abgestoßenem Zellmaterial. In geringer Anzahl können sie bei vielen gesunden Tieren (und auch beim Menschen) gefunden werden.
Foto: Laboklin
Abb. 2: Haarbalgmilben (Demodex canis) und deren Eier (Pfeil); Demodexmilben leben in den Haarfollikeln und ernähren sich von Talg und abgestoßenem Zellmaterial. In geringer Anzahl können sie bei vielen gesunden Tieren (und auch beim Menschen) gefunden werden.

Zytologie

Für die zytologische Beurteilung der Hautoberfläche werden besonders im Hinblick auf die Art einer vorliegenden Entzündung (Abb. 3) oder vorhandene Sekundärinfektionen (Abb. 4) Abklatschpräparate angefertigt.

Objektträger-Abklatsch

Ein Objektträger wird auf die veränderte Hautstelle angedrückt (Abb. 5) und anschließend luftgetrocknet. Beim Abklatsch ist darauf zu achten, dass mit dem Objektträger keinesfalls über die Hautveränderungen gewischt wird, da auf diese Weise die Zellen zerstört werden und mikroskopisch nur noch Kernreste und Chromatinfäden zu sehen sind. Sobald das abgeklatschte Material am Objektträger vollständig getrocknet ist, kann das Präparat gefärbt werden.

Handelsübliche Schnellfärbungen vom Romanovskytyp sind für die Praxis sehr gut geeignet. Prinzipiell sollten die Färbezeiten des Herstellers beachtet werden. In manchen Fällen ist es jedoch notwendig, die Eintauchzeiten zu verlängern: So brauchen zytologische Präparate, die häufig dicker sind als Blutausstriche, länger, bis ausreichend Farbe aufgenommen wird.

Auch wenn die Farbe schon mehrere Wochen verwendet wird, zeigt v. a. die blaue Lösung als erste schlechtere Färbeergebnisse, die an blassen Präparaten zu erkennen sind. Hier kann vorübergehend durch häufigeres oder längeres Eintauchen der Präparate Abhilfe geschaffen und noch ein annehmbares Färbeergebnis erzielt werden. Spätestens wenn auch nach verlängerten Färbe­zeiten die Zellen im Mikroskop noch immer blass erscheinen oder bei einer Kontamination mit Bakterien, müssen die Farblösungen jedoch ausgetauscht werden. In dicht abschließbaren Gefäßen (z. B. Harnbechern, dicht schließenden Gefrierboxen oder Marmeladengläsern) sind die Reagenzien über längere Zeit haltbar als in klassischen Färbe­wannen. Nach dem Abspülen der Farbreste mit Leitungswasser werden die Präparate erneut luftgetrocknet. In eiligen Fällen kann das auch in einem Brutschrank geschehen oder der Vorgang kann durch das Platzieren auf einer warmen Oberfläche (z. B. laufende Laborgeräte) oder einen Haarföhn beschleunigt werden. Im Mikro­skop wird das Präparat zunächst mit geringer Vergrößerung (10x- oder 20x-Objektiv) gescannt, um aussagekräftige Stellen zu finden. Diese werden dann mit hoher Vergrößerung (40x bis 100x, Ölimmersion) eingehend beurteilt.

Abb. 3: Zytologisches Bild von eosinophiler Plaque einer Katze; es sind einige eosinophile und auch neutrophile Granulozyten zu sehen sowie einige Kokken, teilweise phagozytiert in Neutrophilen.
Abb. 4: Pyodermie; neben reichlich degenerierten Neutrophilen sind auch intrazelluläre Kokken zu sehen.
Abb. 5: Anfertigung eines Abklatschpräparats: Der Objekträger wird sanft auf die Haut­oberfläche gedrückt. Keinesfalls wischen, weil dadurch die Zellen zerstört würden.
Abb. 6: Anfertigung eines Klebestreifenabklatschs: Der transparente Klebestreifen wird mehrfach auf das veränderte Hautareal gedrückt, bis ausreichend Material anhaftet.

Klebestreifen-Methode

An schwer zugänglichen Lokalisationen (z. B. Zwischenzehenbereich) oder wenn die Haut so trocken ist, dass am Objektträger kein Material haften bleibt, kann mit der Klebestreifen-Methode gearbeitet werden. Der transparente Klebestreifen wird mehrfach auf das betroffene Hautareal gedrückt, bis ausreichend Material haftet und der Streifen nicht mehr klebt (Abb. 6). Auf die Fixierung kann verzichtet werden, da die Probe durch den Kleber ohnehin fixiert ist und außerdem die alkoholische Fixierlösung viele Klebestreifen trübt. Zum Färben wird der Klebestreifen an ein Ende eines Objektträgers geklebt und mit diesem als Haltegriff in die Farb­lösungen getaucht (Abb. 7). Nach dem Trocknen wird der Klebestreifen erst abgelöst und dann mit der beprobten Seite nach unten über einen Tropfen Öl auf den Objektträger geklebt. Nun wird mikroskopisch nach Mikroorganismen (Bakterien/Stäbchen/Kokken oder Hefen) und Entzündungszellen gesucht. Die vollständige Schritt-für-Schritt-Anleitung für Ihre Ordinationshilfe finden Sie unter hier. In sehr seltenen Fällen können mittels Klebestreifen-Methode auch Hinweise auf andere Hauterkrankungen gefunden werden (z. B. kutanes Lymphom, Pemphigus). Die Beurteilbarkeit der Zellen ist aber aufgrund der unebenen Ober­fläche des Klebestreifens deutlich schlechter als am Objektträger, daher sollte der Klebestreifenabklatsch der Untersuchung auf Sekundärinfektionen und entzündlicher Reaktionen vorbehalten bleiben.

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Abb. 7: Färben des Klebestreifenabklatschs: Der Klebestreifen wird mit einem noch klebenden Ende am Rand eines Objektträgers (als Haltegriff) befestigt und zehnmal in die Farblösung I und anschließend ebenso oft in Lösung II getaucht.
Foto: Maria Christian
Abb. 7: Färben des Klebestreifenabklatschs: Der Klebestreifen wird mit einem noch klebenden Ende am Rand eines Objektträgers (als Haltegriff) befestigt und zehnmal in die Farblösung I und anschließend ebenso oft in Lösung II getaucht.

Trichoskopie

Die Trichoskopie ist die Beurteilung von Haaren im Mikroskop. Auf diese Weise können Sporen oder Hyphen von Dermatophyten und manchmal Parasiten (v. a. Demodexmilben) nachgewiesen sowie Veränderungen in der Struktur der Haare selbst erkannt werden. Die Haare werden mit einer Klemme oder Pinzette ausgezupft, mit etwas Öl auf einen Objektträger verbracht und nach dem Abdecken mit einem Deckgläschen im Mikroskop begutachtet.

Bei jedem Patienten mit Verdacht auf eine Hautpilzerkrankung sollten zeitgleich mit der Proben­entnahme für die Kultur oder PCR die Haare auch trichoskopisch untersucht werden (Abb. 8). Werden Pilzhyphen im Haar gefunden oder sind die Haarschäfte von kugeligen Pilzsporen umgeben, kann die Diagnose Dermatophytose (Pilzinfektion der Haut) prompt gestellt und die Therapie unverzüglich eingeleitet werden. Eine kulturelle Untersuchung oder PCR ist jedoch immer durchzuführen: Einerseits weil die Pilz­elemente im Mikroskop nicht immer gefunden werden, andererseits kann trichoskopisch die Art des Dermatophyten nicht bestimmt werden.

Auch Demodexmilben können mittels Trichoskopie nachgewiesen werden, wenn die Anfertigung eines tiefen Hautgeschabsels aufgrund der Lokalisation (z. B. um die Augen) oder fehlender Compliance des Patienten nicht möglich ist. Die diagnostische Treffsicherheit eines tiefen Hautgeschabsels ist jedoch deutlich höher. Da Demodexmilben direkt im Haarfollikel an den Haarwurzeln leben, können sie oft mit den Haaren ausgezupft werden. Allerdings sollte man die Haut nicht wie beim Geschabsel quetschen, da auf diese Weise die Milben aus dem Haarfollikel gedrückt werden und nicht mehr an der Wurzel der ausgezupften Haare sitzen.

Ein Trichogramm im engeren Sinne (eingehende trichoskopische Untersuchung der Struktur von Haaren) kann vor allem in der Diagnostik von nicht entzündlichen Alopezien – d. h. bei Fellverlust ohne offensichtliche Veränderungen der Haut – hilfreich sein. Mit einer Klemme oder Pinzette, deren Spitzen mit Gummischläuchen überzogen sind, um eine artifizielle Beschädigung der Haare zu vermeiden, werden Haare von veränderten Lokalisationen ausgezupft. Streng genommen sollten 100 Haare mit Paraffinöl parallel auf einen Objektträger gebettet und mit einem Deckgläschen versehen werden. Die Wurzeln, Haarschäfte und Haarspitzen werden im Mikroskop mit niedriger Vergrößerung (4x- oder 10x-Objektiv) beurteilt. Viele Haarwurzeln im Telogenstadium (Ruhestadium der Haare vor dem Ausfall) weisen auf das Vorliegen einer endokrinen Erkrankung (Hypothyreose, Hyperadrenokortizismus) hin. Missgebildete Haarwurzeln lenken die Verdachtsdiagnose in Richtung einer Follikeldysplasie.

Bei Patienten mit Farbmutanten-Alopezie (Color Dilution Alopecia – CDA bei Tieren mit verdünnter Fellfarbe wie z. B. Silber oder Blau) und Alopezie der schwarzen Haare sind in den Haarschäften Melaninklumpen (Abb. 9) zu finden, die schlussendlich zum Abbrechen der betroffenen Haare führen. Das Aussehen der Haarspitzen liefert wichtige Hinweise darauf, ob eine Alopezie möglicherweise durch Automutilation, d. h. durch Belecken oder Knabbern am eigenen Fell, entstanden ist. Besonders Katzen zeigen ihren juckreizbedingt gesteigerten Putztrieb häufig nicht vor dem Besitzer. Findet man im Trichogramm abgebrochene Haarspitzen und Spliss, kann man davon ausgehen, dass doch eine juckende Erkrankung vorliegt.

Abb. 8: Dermatophytose; der Haarschaft ist von Pilzhyphen durchzogen (Pfeil), am Rand sind runde Pilzsporen erkennbar (Stern).
Abb. 9: Farbmutantenalopezie; in den Haarschäften liegen Makromelanosomen, die zum Abbrechen des Haars führen können.

Kulturelle Pilzuntersuchung

Die Haare werden wie für die mikroskopische Untersuchung vom Rand der verdächtigen Läsion ausgezupft und auf das Nährmedium aufgebracht. Bevorzugt werden Haare verwendet, die unter der Wood‘schen Lampe grün fluoreszieren. Zur Untersuchung von symptomlosen Tieren bzw. zur Therapiekontrolle nach Abheilung der Hautveränderungen wird das Material für die Pilzkultur am besten mittels McKenzie-Brush-Methode gewonnen. Mit einer neuen Zahnbürste wird das Fell mindestens fünf Minuten lang gebürstet, bei Therapiekontrollen vor allem an jenen Stellen, die ursprünglich betroffen waren. Danach wird die Bürste leicht auf den Nährboden angedrückt und man überträgt zusätzlich einige Haare in die Schale. Beim Ansetzen der Kultur ist es immer wichtig, dass die Haare gleichmäßig und gut haftend auf dem Boden der Schale zum Liegen kommen, ohne das Medium zu zerstören.

Die beimpften Platten werden täglich kon­trolliert, um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden, die durch die Kultur von Saprophyten/Umgebungspilzen verursacht werden können. Einerseits wird auf das Wachstum von Pilz­kolonien geachtet, die im Fall von Dermatophyten weiß sind. Wachsen hingegen Saprophyten, färben sich die Kolonien grau oder grünlich bis schwarz. Außerdem ist es wichtig, einen möglicherweise auftretenden Farb­umschlag des Testmediums von Rot auf Gelb zu erkennen.

Dermatophyten verursachen schon vor oder spätestens zum Zeitpunkt des Heranwachsens einer Pilzkolonie diesen Farbumschlag, bei Umgebungspilzen erfolgt der Farbwechsel erst Tage nach dem Wachstum der Pilze oder gar nicht. Um die genaue Identität des Pilzes festzustellen, wird mit einem Klebestreifen vorsichtig Material von der Oberfläche der Kolonien entnommen. Auf einen Objektträger wird ein Tropfen Lactophenolblau aufgebracht und der Klebestreifen wird darüber gelegt. So können im Mikroskop die Makrokonidien der verschiedenen Dermatophyten differenziert werden.

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Anfertigung zytologischer Präparate: Worauf ist zu achten?

  • Beim Abklatschen der Hautoberfläche darf keinesfalls über die Hautveränderung gewischt werden, da auf diese Weise die Zellen zerstört werden und mikroskopisch oft nur noch Chromatinreste zu erkennen sind.
  • Das Material muss vor dem Färben oder auch vor dem Verpacken für den Versand vollständig getrocknet sein – dauert das sehr lange, ist das Präparat zu dick und möglicherweise schlecht beurteilbar.
  • Bei der Färbung hält man sich prinzipiell an die Angaben des Herstellers – zytologischische Präparate brauchen allerdings zur ausreichenden Farbaufnahme manchmal länger als Blutausstriche. Ist das Material am gefärbten Präparat noch blassrosa, kann die Färbezeit verlängert werden.
  • Farblösungen sollten in dicht verschließbaren Gefäßen gelagert werden, da besonders die Fixierlösung sehr schnell verdunstet.
  • Färben sich die Präparate trotz verlängerter Eintauchzeiten nicht mehr gut an, müssen die Farblösungen ersetzt werden. Das Gleiche gilt bei einer Kontamination mit Bakterien, die leicht daran zu erkennen ist, dass plötzlich auf allen Präparaten bakterielle Strukturen zu finden sind.

Über die Autorinnen

Dr. med. vet. Maria Christian ist als Tierärztin für Laboklin in Linz tätig. Ihre Hauptaufgaben sind die zytologische Diagnostik sowie die telefonische Kundenberatung im Bereich der klinischen Pathologie und zu dermatologischen Fragestellungen bzw. Allergie-Patienten.

Dr. med. vet.Regina Wagner ist Fachtierärztin für Dermatologie und arbeitet konsiliarisch in verschiedenen Praxen. Der Firma Laboklin steht sie konsiliarisch zum Thema Allergie zur Verfügung und hält regelmäßig Vorträge zu dermatologischen Themen.

Kontakt: Dr. med. vet. Maria Christian, christian@laboklin.com, Dr. med. vet. Regina Wagner, regina.wagner@vetderm.at

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