Berliner und Münchener Tierärztliche Wochenschrift 124, 203-208

DOI: 10.2376/0005-9366-124-203

© Schlütersche Verlagsgesellschaft mbH & Co. KG. 2011

Publiziert: 05/2011

Summary

Equine herpesvirus type 1 (EHV-1) is a major cause of respiratory and reproductive diseases in horses worldwide. The genome of EHV-1 strain 438/77 (isolated from an aborted equine fetus) was cloned as a bacterial artificial chromosome (BAC) in E. coli without any gene deletions. The mini-F plasmid sequence was inserted in the middle of ORF19 and 20 via homologous recombination following co-transfection of viral DNA and plasmid pE19_20/HA into RK13 cells. Circular viral DNA was extracted from RK13 cells infected with purified recombinant virus expressing green fluorescent protein (GFP) and electrophorated into E. coli DH10B cells. The clone harboring the BAC was screened and analyzed by PCR and RFLP. Reconstitution of the recombinant virus was achieved successfully by transfection of the BAC DNA into RK13 cells. The mini-F sequence in the reconstituted virus was subsequently removed by homologous recombination between virus DNA and plasmid pE1920XM, inducing a point mutation in the XbaI site in ORF19. Comparison of RFLP profiles of the rescued, recovered and the wild-type viral genome demonstrated that no unexpected changes occurred during mutagenesis. In vitro replication assays showed that BAC-reconstituted virus mutant growth kinetics and plaque formation morphology/size were indistinguishable to those measured for wild-type virus.

Zusammenfassung

Das Equine Herpesvirus Typ 1 (EHV-1) ist weltweit ein Hauptverursacher von Erkrankungen des Respirations- und Fortpflanzungstraktes bei Pferden. Das Genom des EHV-I Stammes 438/77 (isoliert von einem equinen Abortfeten) wurde ohne jegliche Deletion als bakterielles artifizielles Chromosom (BAC) in E. coli kloniert. Die Mini-F Plasmidsequenz wurde zwischen ORF19 und ORF 20 mittels homologer Rekombination eingefügt. Es folgte die Co-Transfektion von viraler DNA und dem Plasmid pE19_20/HA in RK13 Zellen. Aus mit gereinigtem, rekombinanten Virus infizierten RK13 Zellen, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimierten, wurde zirkuläre virale DNA isoliert und in E.coli DH10B Zellen elektroporiert. Der BAC-DNA enthaltende Klon wurde mittels PCR und RFLP überprüft. Die Rekonstitution des rekombinanten Viruses wurde erfolgreich durch die Transfektion der BAC-DNA in RK13 Zellen erreicht. Die Mini-F Sequenz des rekonstituierten Viruses wurde dann durch homologe Rekombination zwischen der Virus-DNA und dem Plasmid pE1920XM entfernt. Dabei wurde eine Punktmutation in der XbaI Restriktionsschnittstelle des ORFs19 erzeugt. Der Vergleich der RFLP-Profile zwischen dem rekonstituierten Virus mit und ohne Mini-F Sequenz sowie dem Wildtyp Virengenom demonstrierte, dass keine unvorhergesehenen Veränderungen während der Mutagenese stattgefunden haben. In den in vitro Replikationsassays zeigte sich, dass die BAC-rekonstituierte Virusmutante sowohl in den Wachstumskinetiken als auch bezüglich der Plaquemorphologie und der Plaquegröße ununterscheidbar vom Wildtyp-Virus war.