Berliner und Münchener Tierärztliche Wochenschrift 123, 205-209

DOI: 10.2376/0005-9366-123-205

© Schlütersche Verlagsgesellschaft mbH & Co. KG. 2010

Publiziert: 05/2010

Summary

A multiplex real-time PCR assay was developed to detect and quantify B. hyodysenteriae, B. pilosicoli, and L. intracellularis in pig faeces. Specific probes and primers were directed against the NADH oxidase (nox) gene of Brachyspira and the aspartate ammonia lyase (aspA) gene of L. intracellularis, respectively. The analytical sensitivity for the real-time PCR assay, expressed as limit of detection (LOD) was below 10 DNA copies for L. intracellularis, 14 DNA copies for B. pilosicoli and 26 DNA copies per PCR reaction for B. hyodysenteriae. The experimental sensitivity, expressed as limit of quantitation (LOQ) for the real-time PCR assay was set to 100 DNA copies per PCR reaction which equals 8 x 103 cells per gram of faeces. The multiplex real-time PCR was tested in parallel to conventional PCR on 749 faecal samples from 121 farms. 73 (9.7%), 30 (4%), and 30 (4%) faecal samples were positive for L. intracellularis, B. hyodysenteriae, and B. pilosicoli, respectively by conventional PCR and 59 (7.9%), 27 (3.6%), and 7 (0.9%) by multiplex real-time PCR. From the real-time PCR positive results 34 (4.5%), 25 (3.3%), and 4 (0.5%) were above the LOQ. The multiplex real-time PCR will allow rapid and quantitative detection of clinical relevant amounts of the three key porcine enteric pathogens simultaneously.

Zusammenfassung

Der Artikel beschreibt eine Multiplex Realtime-PCR zum Nachweis und zur Quantifizierung von B. hyodysenteriae, B. pilosicoli und L. intracellularis in Schweinekot. Primer und Sonden richten sich gegen das NADH-Oxidase-Gen (nox) von Brachyspira und die Aspartat-Ammonium-Lyase (aspA) von Lawsonia intracellularis. Die analytische Sensitivität der PCR, ausgedrückt als LOD (limit of detection) lag je Ansatz unter 10 DNA-Kopien für L. intracellularis, 14 DNA-Kopien für B. pilosicoli und 26 DNA-Kopien für B. hyodysenteriae. Die experimentelle Sensitivität zur Quantifizierung (LOQ; limit of quantitation) ergab sich als 100 DNA-Kopien je PCRAnsatz. Dies entspricht einem Grenzwert von 8 x 103 Zellen pro Gramm Kot. Die Multiplex Realtime PCR wurde auf Basis von 749 Kotproben aus 121 nicht näher definierten Betrieben mit einer konventionellen PCR verglichen. In der konventionellen PCR waren jeweils 73 (9,7 %), 30 (4 %), und 30 (4 %) der Kotproben positiv für L. intracellularis, B. hyodysenteriae und B. pilosicoli. Jeweils 59 (7,9 %), 27 (3,6 %) und 7 (0,9 %) der Kotproben waren positiv mittels Multiplex Realtime PCR. Von den Realtime PCR positiven Proben lagen 34 (4,5 %), 25 (3,3 %) und 4 (0,5 %) innerhalb des LOQ. Die Multiplex Realtime PCR ermöglicht den raschen, synchronen und quantitativen Nachweis wichtiger enteropathogener Bakterien.